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シッピシグ・タグ付加レコンビナント蛋白質の髄液内投与と悪性脳腫瘍治療への応用

SIPISIG重组蛋白脑脊液注射及其在恶性脑肿瘤治疗中的应用

基本信息

批准号：
12877215
负责人：
生塩之敬
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877215/
关键词：
TATペプチド融合蛋白 TAT-lacZ TAT-p16 髄腔内播種悪性脳腫瘍 C6グリオーマ細胞 TAT-GFP

项目摘要

【目的】悪性脳腫瘍の髄腔内播種は極めて難治性であり、新しい治療法の開発が切望される病態である。AIDS virusの部分蛋白であるTATペプチドは僅か11アミノ酸の配列であるが、そのC末側に120kDもの大きな蛋白が融合されても、あらゆる細胞内へ効率よく侵入する機能を持つ。この機能に注目し、細胞周期制御因子をTATペプチド融合蛋白として髄腔内に投与することにより、細胞の分裂を停止して播種細胞特異的な治療を行う事を目的として研究を行った。【方法】Washington大学Steven Dowdy博士より供与されたTAT-LacZ,TAT-GFP,TAT-p16(wild type),TAT-p16(mutant)の各融合蛋白発現プラスミドを用い、融合蛋白を大腸菌より精製した。これらの蛋白を用い、1)in vitroでC6ラットグリオーマ細胞へ各蛋白を導入し、導入効率を解析すると同時に、細胞周期への影響を解析した。2)正常ラットの髄腔内に各蛋白を注入し、融合蛋白の分布と毒性を解析した。3)C6細胞の髄腔内播種モデルを作成し、その髄腔内にTAT-LacZを注入し、蛋白の分布を解析した。【結果】1)in vitroの系でTAT-LacZ蛋白は用量依存的にC6細胞に導入され、特に核内への分布が確認された。2)15mg/mlという濃度で100%の細胞に蛋白が導入されが、細胞密度が低い状態ではより低い濃度で100%の細胞に導入可能であった。3)コントロールとして用いたTATが付加されていないLacZ蛋白はC6細胞内へは全く導入されなかった。4)導入には少なくとも8時間の細胞との接触が必要であった。5)TAT-GFPも同様に100%の細胞に導入可能であった。6)TAT-p16が核内に導入された細胞ではS期細胞の著名な減少が観察された。7)髄腔内に注入したTAT-LacZ蛋白はくも膜下腔全体に広がり、播種性のC6細胞及び脳表の組織に導入された。8)TAT-LacZ,TAT-p16を髄腔内に注入することによる毒性は認められなかった。【結論】TAT融合蛋白を用いることにより、髄腔内播種細胞の核内へ効率よく蛋白分子を送り込む事が可能である。TAT-p16の髄腔内投与は重篤な副作用もなく、治療効果が期待される。今後はTAT-p16やTAT-p27を用いた播種モデルの治療実験を行う予定である。

[Objective] Intracavitary seeding of malignant tumors is extremely difficult to treat, and the development of new treatments is eagerly awaited. Some of the AIDS virus proteins contain TAT proteins that are only 11-kD in length and 120-kD in length. The function of TAT, a cell cycle control factor, is to be studied in order to stop cell division and to seed cell-specific therapies. [Methods] Dr. Steven Dowdy, University of Washington, provided the fusion proteins of TAT-LacZ,TAT-GFP,TAT-p16(wild type) and TAT-p16(mutant) for development and purification. 1) Analysis of the effect of protein introduction on cell cycle 2)Analysis of the distribution and toxicity of fusion proteins after injection into the normal cavity 3)C6 cells were seeded into the cavity, TAT-LacZ was injected into the cavity, and protein distribution was analyzed. [Results] 1) TAT-LacZ protein in vitro was introduced into C6 cells in a dose-dependent manner, and the distribution of TAT-LacZ protein in the nucleus was confirmed. 2)15mg/ml or 100% of the cell protein may be introduced, cell density may be low or 100% of the cell protein may be introduced. 3) LacZ protein was introduced into C6 cells completely. 4)8 hours of cell contact is necessary 5) 100% of cells with TAT-GFP isozyme can be introduced. 6)TAT-p16 was introduced into the nucleus of the cells, and the number of S phase cells decreased significantly. 7) The TAT-LacZ protein was injected into the submembranous cavity and introduced into C6 cells and tissues. 8)TAT-LacZ,TAT-p16 is injected into the cavity. [Conclusion] TAT fusion protein can be used in cell nucleus of seed cells. TAT-p16 is administered intracavitary to patients with severe side effects and expectant therapeutic effects. In the future, TAT-p16 and TAT-p27 will be used to seed the treatment.