超機能金属タンパク質の作製とセンシングおよび光エネルギー変換素子への応用

超功能金属蛋白的制备及其在传感和光能转换器件中的应用

• 批准号: 01J00398
• 负责人: 三重 安弘
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00398/
• 关键词: 硝酸還元酵素; グラファイト"エッジ"電極; 回転電極; アンペロメトリックセンサー; ニトロフォリン; メディエーター分光電気化学; 酸化還元電位; シトクロムb562; 機能修飾電極; Superoxide dismutase (SOD); "逆"同位体効果; 再配列エネルギー; 光還元反応; NADPH; 薄層分光電気化学測定; マルチレドックス酵素

1.大腸菌の嫌気下での呼吸において誘導される硝酸還元酵素(触媒部位にMoイオンを持つ)を、パイロリティックグラファイトのエッジ電極を用いることで、電極表面上に活性を保持したまま安定に固定化することができた。この酵素固定化電極を回転電極法により解析したところ、酵素反応がMo^<5+>の時に活性が最大になることを見いだし、酵素反応機構解明のための大きな知見を得た。またこの電極が硝酸イオンのアンペロメトリックセンサーとして応用できることが示唆された。2.電極との直接電子移動制御が困難なCooAやニトロフォリンといったヘムタンパク質について、メディエーターを用いた分光電気化学法を用いることで、酸化還元電位を評価することができた。ヘムを利用したNO運搬機能を持つニトロフォリンは、同じヘム鉄イオン配位構造を持つミオグロビンなどに比べ200mV以上負な電位を示した。この機構を明らかにするため、ヘム近傍の荷電アミノ酸に変異を施した3種の変異体(D30N, D70N, K125Q)を作製し、電位評価を行ったところ、どの変異型も天然型をほぼ同じ電位を示したことから、ニトロフォリンの電位制御には、一つのアミノ酸が大きく寄与しているのではなく、ヘム周囲のアミノ酸三次構造全体で鉄イオンの電子密度を上げていると推察された。3.酸化還元電位が未知の金属タンパク質のメディエーター型分光電気化学測定において、従来の、一つ一つメディエーターを試行錯誤的に試す方法ではなく、異なる電位を持つメディエーターを多数用いた測定をまず行い、そこからおおよその電位を評価し、最適なメディエーターを絞っていくという方法が、非常に汎用性に優れた方法であることがわかり、比較的容易に天然および半人工型金属タンパク質の電位を評価できた(投稿準備中)。4.αヘリックスが4本バンドルした構造を持つヘムタンパク質、シトクロムb562、のバンドル部位に、システイン残基を施した変異分子を作製し、高純度なサンプルを得ることができた。この変異タンパク質は、(1)システイン残基により金属-硫黄結合で、金、銀、銅などの金属電極表面に容易に配向固定化が可能、(2)シトクロムb562は、酸化還元における再配列エネルギーが小さく電子移動制御が容易、(3)活性部位にNOガスなどの結合部位を作製することが可能、という特徴を持っており、新規なセンサー素子として期待できる。

1. Coliform の under suspicion 気 で の breathing に お い て induced さ れ る nitrate also yuan enzyme (catalyst sites に Mo イ オ ン を つ) を, パ イ ロ リ テ ィ ッ ク グ ラ フ ァ イ ト の エ ッ ジ を electrode with い る こ と に で, electrode surface active を keep し た ま ま settle に immobilized す る こ と が で き た. こ の enzyme immobilization electrode を planning back electrode に よ り parsing し た と こ ろ, enzyme 応 が Mo ^ < 5 + > の active が に biggest に な る こ と を see い だ し, enzyme reverse 応 agencies interpret の た め の big き な knowledge を た. ま た こ の electrode が nitrate イ オ ン の ア ン ペ ロ メ ト リ ッ ク セ ン サ ー と し て 応 with で き る こ と が in stopping さ れ た. 2. Electrode と の directly electronic mobile suppression が difficult な CooA や ニ ト ロ フ ォ リ ン と い っ た ヘ ム タ ン パ ク qualitative に つ い て, メ デ ィ エ ー タ ー を with い た spectral 気 chemical method を with い る こ と で, acidification and yuan potential を 価 す る こ と が で き た. ヘ ム を using し た NO handling function を hold つ ニ ト ロ フ ォ リ ン は, with じ ヘ ム iron objects イ オ ン ligand structure を hold つ ミ オ グ ロ ビ ン な ど に than more than 200 mv べ negative な potential を shown し た. こ の institutions を Ming ら か に す る た め, ヘ ム nearly alongside の charged ア ミ ノ acid に - different を shi し た three の - variants (D30N D70N, を K125Q) for し, potential evaluation 価 を line っ た と こ ろ, ど の - different type も natural を ほ ぼ with じ potential を shown し た こ と か ら, ニ ト ロ フ ォ リ ン の potential suppression に は, a つ の ア ミ ノ acid が big き く send し て い る の で は な く, ヘ ム weeks 囲 の ア ミ ノ acid all three tectonic で iron objects イ オ ン の electron density on を げ て い る と was found Youdaoplaceholder0. 3. Potential acidification and yuan が unknown の metal タ ン パ ク qualitative の メ デ ィ エ ー タ ー type electric 気 spectroscopic determination of chemical に お い て; の 従 come, a つ つ メ デ ィ エ ー タ ー を try try out wrong に で す method は な く, different な る potential を hold つ メ デ ィ エ ー タ ー を most use い た determination を ま ず い, そ こ か ら お お よ そ の potential を review 価 し, optimal な メ デ ィ エ ー タ ー を ground っ て い く と い が う method, very に domestic に れ た method で あ る こ と が わ か り, compare easy に natural お よ び half artificial metal タ ン パ ク qualitative の potential を review 価 で き た (contribute to). 4. Alpha ヘ リ ッ ク ス が 4 this バ ン ド ル し た tectonic を hold つ ヘ ム タ ン パ ク qualitative, シ ト ク ロ ム b562, の バ ン ド ル parts に, シ ス テ イ ン residues を shi し た - different molecular を make し, high purity な サ ン プ ル を have る こ と が で き た. こ の - different タ ン パ ク は, (1) シ ス テ イ ン residues に よ り metal - sulfur combining で, gold, silver, copper な ど の metal electrode surface easy に に match to the immobilized が may, (2) シ ト ク ロ ム b562 は, acidification and yuan に お け る with column エ ネ ル ギ ー が small さ く electronic mobile royal が easy, (3) active site に NO ガ ス な ど の knot Close parts を cropping す る こ と が may, と い う, 徴 を hold っ て お り, new rules な セ ン サ ー element child と し て expect で き る.

项目成果

MIE, Yasuhiro: "Functional Evaluation of Heme Vinyl Groups in Myoglobin with symmetric Protoheme Isomers"Biochemistry. 発表予定.

MIE，Yasuhiro：“用对称原血红素异构体对肌红蛋白中血红素乙烯基进行功能评估”生物化学。

TANIGUCHI, Isao: "Analysis of Biological Functions of Metalloproteins Using Biocompatible Modified Electrodes"Anal. Sci.. 17. 1355-1358 (2001)

TANIGUCHI, Isao：“使用生物相容性修饰电极分析金属蛋白的生物学功能”分析。