直接電気化学法を用いたCYPのハイスループット薬物代謝活性計測ツールの開発

直接电化学法高通量CYP药物代谢活性测定工具的开发

• 批准号: 18790036
• 负责人: 三重 安弘
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790036/
• 关键词: シトクロムP450(CYP); 一塩基多型; 薬物代謝活性; 膜結合蛋白; 配向固定; 電気化学活性計測; 薄膜コーティング; 直接電子移動; CYP; 電極界面; 電子移動; 薬物代謝; ポリイオン薄膜

本年度は,まず昨年度に見出したポリイオン膜を用いる手法により,CYP2C9の固定化を行い電気化学的な薬物代謝活性計測を検討した。代表的な薬物であるジクロフェナックについてミカエリス・メンテン型の電流応答(酵素反応応答)が得られ,kmとして18μMが見積もられた。これは,従来法で得られている値(3-52μM)とよく一致した。しかしながら,このポリイオン膜を用いる手法ではイオン強度等の条件によりCYP酵素が容易に電極界面から剥がれ,計測に対する安定性が不十分であることが明らかになった。そこで新たな固定化法の鋭意検討を行った結果,電極界面に凹凸を持たせ疎水性の超薄膜(〈5nm)でコーティングするとその界面上にCYP酵素が安定に固定化されることを発見した。CYP酵素は膜結合型の蛋白質であり疎水性の膜結合部位と疎水性の電極界面との相互作用が主要な固定化力として働いていると予想された。4℃の緩衝溶液中において1ヶ月以上の保存が可能であった。また,この方法では従来法よりも迅速な電極-CYP酵素間の電子移動を生じさせる事ができ(現在までに報告されているヒトCYPの電子移動速度定数の3-100倍程度),これにより従来法では困難であったCYP酵素の酸化還元物性評価,すなわち酵素反応特性の重要な因子である酸化還元電位に及ぼす基質薬物結合やpH等の影響を明瞭かつ迅速に調べることも可能となった(投稿論文準備中)。更に,アルゴン通気条件下ではCYP2C9についてその主要な代謝薬物であるジクロフェナックやトルブタミドに対して適切なkm値を見積れることも確認され,安価な電極を利用したCYPの酵素反応評価を簡便な電気化学計測で行えることが示された。固定化電極の高感度反射FTIR測定からは,CYP分子が電極界面で配向固定されていることも示唆されている。電極一酵素間の迅速な電子移動および溶媒中の基質との代謝反応の両方をスムースに進行させるにはこの配向固定化が重要であると考えられた。この系を簡易的なフローシステムに適用し定電位電解計測を行ったところ,基質薬物濃度に応じた電流応答も得られた。

This year, the method of immobilization of CYP2C9 and the measurement of its metabolic activity were investigated. The current response (enzyme response) of the type represented by the compound was obtained at km and 18μM. The method of extraction was found to be accurate (3-52μM). For CYP enzymes, electrode interfaces are easy to peel off and measurement stability is poor. As a result of the investigation of the new immobilization method, the stable immobilization of CYP enzymes on the electrode interface was found in the presence of an aqueous ultra-thin film (<5nm). CYP enzymes are mainly immobilized by membrane-bound proteins, water-bound membrane-bound sites, water-bound electrode interfaces and interactions. It is possible to store in buffer solution at 4℃ for more than 1 month. This method is based on rapid electrode-CYP enzyme electron transfer.(Now we report that the electron transfer speed of CYP is about 3-100 times higher than that of other CYP enzymes). Therefore, it is difficult to evaluate the acidification reduction properties of CYP enzymes by using this method, and it is possible to clarify the effects of acidification reduction potential, substrate binding, pH, etc. on the important factors of enzyme reaction characteristics (preparation of submission paper). In addition, the main metabolites in CYP2C9 can be evaluated by measuring the appropriate values of CYP2C9 in the presence of oxygen. High sensitivity reflectance FTIR measurements of immobilized electrodes show that CYP molecules are aligned and immobilized at the electrode interface. The rapid electron transfer between electrodes and substrates in solvents is important for the immobilization of the alignment. This is a simple system for measuring the concentration of substances in a constant potential.

项目成果

CYP2C9の電極上への固定化と電気化学的薬物代謝活性評価

CYP2C9在电极上的固定化及药物代谢活性的电化学评价

• 发表时间: 2007
• 作者: 桝飛雄真;片桐幸輔;加藤貴子;富永昌英;影近弘之;東屋功;R. Ikeda;三重 安弘
• 通讯作者: 三重 安弘

電極を用いたシトクロムP450(CYP)の簡便活性計瀾の検討

简易电极式细胞色素P450（CYP）活性仪的研究

• 发表时间: 2007
• 作者: 桝飛雄真;片桐幸輔;加藤貴子;富永昌英;影近弘之;東屋功;R. Ikeda;三重 安弘;三重 安弘
• 通讯作者: 三重 安弘