蛋白質相互作用に基づくシアノバクテリアの概日時計蛋白質の探索と解析

基于蛋白质相互作用的蓝藻生物钟蛋白搜索与分析

• 批准号: 01J01761
• 负责人: 北山 陽子
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J01761/
• 关键词: シアノバクテリア; 生物時計; 転写制御; Far-western法; 遺伝子の転写制御

本研究では、シアノバクテリアにおいて生物リズムをつくりだすもととなるタンパク質を同定する試みを行った。シアノバクテリアにおいてはkaiABC遺伝子群が生物リズムの発生と維持に必須の働きをもっており、特にKaiCタンパク質が生物時計機構の中心要素であることが分かっている。そこで、私はKaiA,KaiB,KaiCと相互作用するタンパク質をYeast Two-Hybrid法及びFar-western法を用いて探索した。Yeast Two-Hybridスクリーニングで得られた候補遺伝子は残念ながらどれも擬陽性のクローンであったことが判明したが、Far-western法でKaiCタンパク質の結合因子をスクリーニングした結果、いくつか候補遺伝子が得られた。さらにそれらについて解析をすすめた結果、そのうちの一つの遺伝子がin vitroでもKaiCに結合することが確認できた。そこでDNAハイブリダイゼーションを行い、全長のクローニングをおこなったところその遺伝子はDNA複製の開始因子であるdnaAと高い相同性をもつ遺伝子であることがわかった。この遺伝子のシアノバクテリア概日時計機構における機能を明らかにするため、破壊株の作製、発現解析、細胞内におけるKaiCとDnaAの相互作用測定、二重変異株を作製し遺伝的相互作用のなどをおこなった。それらの結果から、シアノバクテリアにおいてはdnaA遺伝子がKaiCと相互作用して概日リズムを維持する働きがあることが明らかになった。

This research is based on biotechnology researchくりだすもととなるタンパク性を同定するtrialみを行った.シアノバクテリアにおいてはkaiABC缝子群がbiotic リズムの発生とMaintenanceにMustの働きをもっており、特にKaiCタンパクqualityがThe central element of the biochronometer mechanism is であることが分かっている.そこで、private はKaiA,KaiB,KaiCとinteraction するタンパクquality をYeast Two-Hybrid method and びFar-western method いてExploration した. Yeast Two-Hybrid System Cannian ながらどれもpseudo-positive のクローンであったことが见明したが, Far-western method's KaiC タンパクquality のcombination factor をスクリーニングした results, いくつか candidate supplement 伝子が got られた.さらにそれらについてanalytic をすすめた results, そのうちの一つの伝子がin vitroでもKaiCにcombinationすることがconfirmationできた.そこでDNAハイブリダイゼーションを行い, full length のクローニングをおこなったところその remain伝子はDNA replication start factor であるdnaA と高いidentity をもつ伝子であることがわかった.この伝子のシアノバクテリア合日时时器におけるFUNCTIONAL を明らかにするため、波壊区のproduction、発现analyses、details Intracellular KaiC and DnaA interaction assay, double-cross-linked heterogeneous plant production, and interaction of intracellular KaiC and DnaA.それらのRESULTから、シアノバクテリアにおいてはdnaA伝子がKai Cとinteractionして合日リズムをmaintainする働きがあることが明らかになった.

项目成果

Kitayama Y, Iwasaki H, Nishiwaki T, Kondo T: "KaiB functions as an attenuator of KaiC phosphorylation in the cyanobacterial circadian clock system"EMBO J. 22. 2127-2137 (2003)

Kitayama Y、Iwasaki H、Nishiwaki T、Kondo T：“KaiB 在蓝藻生物钟系统中充当 KaiC 磷酸化的衰减器”EMBO J. 22. 2127-2137 (2003)

Kitayama Y, Kondo T, Nakahira Y, Nishimura H, Ohmiya Y, Oyama T: "An In vivo Dual-Reporter System of Cyanobacteria Usina Two Railroad-Worm Luciferases with Different Color Emissions"Plant Cell Physiology. 45. 109-113 (2004)

Kitayama Y、Kondo T、Nakahira Y、Nishimura H、Ohmiya Y、Oyama T：“使用两种具有不同颜色发射的铁路蠕虫荧光素酶的蓝藻体内双报告系统”植物细胞生理学。