イソキノリンアルカロイド生合成メチル化酵素の分子解剖

异喹啉生物碱生物合成甲基转移酶的分子解剖学

• 批准号: 01J03146
• 负责人: 森重 敬
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03146/
• 关键词: イソキノリンアルカロイド; オウレン; O-メチル化酵素

ベルベリンの生合成経路上に存在する3つのO-メチル化酵素(OMT)、ノルコクラウリン6-O-メチル化酵素(6-OMT)、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチル化酵素(4'-OMT)、スコウレリン9-O-メチル化酵素(SMT)は厳密な基質特異性を有しており、これらO-メチル化酵素の反応特異性により、順序正しい生合成と生合成制御が行われている。如何にこのような反応特異性をもつO-メチル化酵素が進化してきたかを理解し、利用することは、酵素の分子機構の理解と新規な認識・反応特異性を有する酵素の創造による代謝工学の基盤を確立する上で極めて有用である。本研究ではこれらのOMTの一次構造と反応特異性の関係を明らかとすることを目的とした。昨年度までに、6-OMTと4'-OMTの間でN末端側を細分化させたキメラ酵素を作製し、その解析によりOMTのN末端側の90アミノ酸が基質認識を決定していることを明らかとしていた。本年度は作製したキメラ酵素の精製と精製酵素を用いた酵素化学的解析を試みた。キメラ酵素を大腸菌で発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。いくつかのキメラ酵素は精製の過程で活性が失われてしまったが、活性を有したまま精製された酵素1種についてKm値、Vmaxを求め、また詳細な基質特異性解析を行った。その結果、同様に大腸菌で発現、精製した4'-OMTに比べ、同等のKm値、Vmaxでありながら、より基質特異性の高い酵素であることが明らかとり、OMTの基質特異性の改変が可能であることを示した。また、関連するアルカロイド生合成系のOMTの構造と機能について、さらなる知見を得るために、すでに単離されていたコロンバミンO-メチル化酵素遺伝子について組換え酵素を用い、その詳細な酵素化学的解析を行った。その結果、これまで本酵素の基質と考えられていたアルカロイド以外にも、同等の基質となりうるアルカロイドを見い出し、従来考えられていた生合成経路について再検討が必要であることを示した。

There are する3つのO-メチルzyme (OMT) and ノルコクラウリン6-O on the way to synthetic synthesis -メチルzyme (6-OMT), 3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルzyme SMT (4'-OMT), スコウレリン9-O-メチルzyme (SMT) は峳なMatrix-specific を有しており、これらO-メチル化zymeのreaction specificityにより、sequence positive biosynthetic and biosynthetic controlが行われている. How to understand and use enzyme molecular machine to react with specific enzymes and enzymes? The understanding of structure, understanding of new rules and reaction specificity, creation of enzymes, and establishment of the foundation of metabolic engineering are the basis for the most effective use of enzymes. The purpose of this study is to determine the relationship between the primary structure and response specificity of OMT. Last year's までに、6-OMT and 4'-OMTの间でN terminal side をsubdivided させたキメラ enzyme をproduced し、そのANALYSISによりOMTのN-terminal sideの90アミノAcidがMatrix recognitionをdeterminationしていることを明らかとしていた. This year, we conducted a test on the analysis of the enzyme chemistry used in the production of purified and purified enzymes. The キメラ enzyme を coliform で発appears させ, カラムクロマトグラフィーにより refined を行った.いくつかのキメラEnzyme は Refining process でActivity が Loss われ て し ま っ たが、Activity をThere し た ま ま RefiningされたEnzyme 1 typeについてKm value, Vmaxをquestめ,またDetailed matrix specific analysisを行った.その results, same 様に coliform で発 appear, refined した4'-OMT に比べ, equivalent のKm夤, Vmax でありながら, よりMatrix-specific high-enzyme であることが明らかとり, OMT のmatrix-specific のchanged value がpossible であることをshow した.また、related するアルカロイド生综合组のOMTのstructuralとfunctionについて、さらなる知见を得るために、すでに単利されていたコロンバミンO-メチル化zyme residual enzyme について group replacement enzyme を use い, そのDetailed analysis of enzyme chemistry を行った.そのRESULTS, これまで本ENzymeの卡えられていたアルカロイドにも, Same as the base となりうるアルカロイドを见い出し、従来考えられていた生成経路 について 検问が必であることをshowした.

项目成果

森 重敬: "Molecular cloning of columbamine O-methyltransferase from cultured Coptis japonica cells"European Journal of Biochemistry. 269. 5659 (2002)

Shigetaka Mori：“来自培养的黄连细胞的鸽胺 O-甲基转移酶的分子克隆”欧洲生物化学杂志 269. 5659 (2002)。