超好熱菌の新規な構造を持つキチナーゼとキチン資化経路に関する研究

新型超嗜热菌结构几丁质酶及几丁质同化途径的研究

• 批准号: 01J03402
• 负责人: 田中 丈士
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03402/
• 关键词: eco-β-glucosaminidase; chitin; Archaea; 超好熱菌; バイオマス; 耐熱性酵素; 糖質関連酵素

これまでに超好熱始原菌T.kodakaraensis KOD1由来キチナーゼが1分子内に2つの異なる切断様式の触媒ドメインを有し、キチンを2糖(GlcNAc_2)にまで分解する事を明らかにしてきた。一方で、T.kodakaraensisゲノムにはGlcNAc_2代謝系酵素の相同遺伝子が存在していない。そこで平成14年度は、本菌のGlcNAc_2代謝に関わる酵素を同定し、その代謝経路を明らかにする事を目的とした。GlcNAc_2のβ-1,4-結合分解活性を指標にKOD1株無細胞抽出液からN-acetyl-β-glucosaminidase(NAGase)を部分精製し、活性染色により目的タンパク質を同定した。そのN末端アミノ酸配列から対応する遺伝子をT.kodakaraensisゲノム中に見いだした。本遺伝子は2358塩基からなり786アミノ酸残基のタンパク質をコードしており、その推定アミノ酸配列はN末端側の約4分の1がβ-ガラクトシダーゼと相同性を示したが、残りの4分の3は始原菌の機能未知タンパク質以外とは相同性を示さなかった。本遺伝子を大腸菌で発現させ、精製した組換え体は予想に反しGlcNAc_2は分解せず、脱アセチル化されたGlcN_2を分解するexo-β-D-glucosaminidase(Tk-Glm)であることを明らかにした。無細胞抽出液に認められたNAGase活性は脱アセチル化酵素とTk-Glmによる二段階反応によるものであると推定され、新たなキチン代謝経路の存在が示唆された。Tk-Glmは90kDaのサブユニットからなるホモ2量体で、反応至適pH、温度はそれぞれ6.0、80℃であった。キトサンオリゴ糖やその還元体の分解物のTLC分析から、本酵素はオリゴ糖の非還元末端から単糖単位で加水分解するエキソ型酵素であることを示した。本酵素はexo-β-D-glucosaminidaseとして初めて遺伝子が同定されたものである。現在、本研究の成果をまとめた論文を学術誌に投稿中である。

こ れ ま で に super hot starting the original bacterium T.k odakaraensis KOD1 origin キ チ ナ ー ゼ が 1 intramolecular に 2 つ の different な る の to cut off others in catalytic ド メ イ ン を し, キ チ ン を 2 sugar (GlcNAc_2) に ま decomposition of で す る matter を Ming ら か に し て き た. The 伝 が of で and t. kodakaraensisゲノムに ゲノムに GlcNAc_2 metabolic system enzymes are present, て て な な な. 14 year は そ こ で pp.47-53, the bacteria の GlcNAc_2 metabolic に masato わ を る enzyme with し, そ metabolic 経 の way を Ming ら か に す る matter を purpose と し た. GlcNAc_2 の beta 1, 4 - combining を index decomposition activity に KOD1 plant cell free extract か ら N - acetyl - beta glucosaminidase (NAGase) を part refined し, reactive dyeing に よ り purpose タ ン パ ク qualitative を be し た. そ の N terminal ア ミ ノ acid with column か ら 応 seaborne す る posthumous son 伝 を T.k odakaraensis ゲ ノ ム に seen い だ し た. This heritage 伝 son は 2358 salt base か ら な り 786 ア ミ ノ acid residues の タ ン パ ク qualitative を コ ー ド し て お り, そ の presumption ア ミ ノ acid with column は N terminal side の の about 4 points 1 が beta ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ と identity を shown し た が and residual り の 4 の beginning 3 は function of the original bacteria の unknown タ ン パ ク mass outside と は identity を shown さ な か っ た. This heritage 伝 son を coliform で 発 now さ せ, refined し た group in は え body to think に anti し GlcNAc_2 は decomposition せ ず, ア セ チ ル change さ れ た GlcN_2 を decomposition す る exobiology - beta - D - glucosaminidase (Tk - Glm) で あ る こ と を Ming ら か に し た. Cell-free extract に recognize め ら れ た NAGase active は ア off セ チ ル phenoloxidase と Tk - Glm に よ る two Duan Jie anti 応 に よ る も の で あ る と presumption さ れ, new た な キ チ ン metabolic の exist が 経 road in stopping さ れ た. Tk - Glm は 90 kda の サ ブ ユ ニ ッ ト か ら な る ホ モ 2 quantity body で, anti 応 to optimal pH, temperature は そ れ ぞ れ 6.0, 80 ℃ で あ っ た. キ ト サ ン オ リ ゴ sugar や そ の is の yuan body decomposition の TLC analysis か ら, this enzyme は オ リ ゴ sugar の the end of the yuan also か ら 単 sugar 単 a で hydrolytic decomposition す る エ キ ソ type enzyme で あ る こ と を shown し た. This enzyme, <s:1> exo-β -d-glucosaminidase, と, て, めて, 伝, が, された, <s:1>, である, である. Now, the をまとめた results of this research, the を paper, is being submitted to the academic journal に at である.

项目成果

全 崇鍾, 藤原 伸介, 高木 昌宏, 田中 丈士, 今中 忠行: "Tk-PTP, protein tyrosine/serine phosphatase from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 : enzymatic characteristics and identification of its substrate proteins"Biochemical and Biophysical Research Co

Takashi Zen、Shinsuke Fujiwara、Masahiro Takagi、Takeshi Tanaka、Tadayuki Imanaka：“Tk-PTP，来自超嗜热古菌 Thermococcus kodakaraensis KOD1 的蛋白质酪氨酸/丝氨酸磷酸酶：酶学特征及其蛋白质底物的鉴定”生化和生物物理研究公司