超好熱菌の新規な構造を持つキチナーゼとキチン資化経路に関する研究

新型超嗜热菌结构几丁质酶及几丁质同化途径的研究

• 批准号: 01J03402
• 负责人: 田中 丈士
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03402/
• 关键词: eco-β-glucosaminidase; chitin; Archaea; 超好熱菌; バイオマス; 耐熱性酵素; 糖質関連酵素

これまでに超好熱始原菌T.kodakaraensis KOD1由来キチナーゼが1分子内に2つの異なる切断様式の触媒ドメインを有し、キチンを2糖(GlcNAc_2)にまで分解する事を明らかにしてきた。一方で、T.kodakaraensisゲノムにはGlcNAc_2代謝系酵素の相同遺伝子が存在していない。そこで平成14年度は、本菌のGlcNAc_2代謝に関わる酵素を同定し、その代謝経路を明らかにする事を目的とした。GlcNAc_2のβ-1,4-結合分解活性を指標にKOD1株無細胞抽出液からN-acetyl-β-glucosaminidase(NAGase)を部分精製し、活性染色により目的タンパク質を同定した。そのN末端アミノ酸配列から対応する遺伝子をT.kodakaraensisゲノム中に見いだした。本遺伝子は2358塩基からなり786アミノ酸残基のタンパク質をコードしており、その推定アミノ酸配列はN末端側の約4分の1がβ-ガラクトシダーゼと相同性を示したが、残りの4分の3は始原菌の機能未知タンパク質以外とは相同性を示さなかった。本遺伝子を大腸菌で発現させ、精製した組換え体は予想に反しGlcNAc_2は分解せず、脱アセチル化されたGlcN_2を分解するexo-β-D-glucosaminidase(Tk-Glm)であることを明らかにした。無細胞抽出液に認められたNAGase活性は脱アセチル化酵素とTk-Glmによる二段階反応によるものであると推定され、新たなキチン代謝経路の存在が示唆された。Tk-Glmは90kDaのサブユニットからなるホモ2量体で、反応至適pH、温度はそれぞれ6.0、80℃であった。キトサンオリゴ糖やその還元体の分解物のTLC分析から、本酵素はオリゴ糖の非還元末端から単糖単位で加水分解するエキソ型酵素であることを示した。本酵素はexo-β-D-glucosaminidaseとして初めて遺伝子が同定されたものである。現在、本研究の成果をまとめた論文を学術誌に投稿中である。

已经表明，源自高疗原始细菌的几丁质酶T. kodakaraensis kod1具有一个分子内的两个不同的切割型催化域，将几丁质降解为二糖（GlcNAC_2）。另一方面，Kodakaraensis基因组不包含GlcNAC_2代谢酶的同源基因。因此，在2002年，目的是确定与该细菌的GlcNAC_2代谢有关的酶，并澄清其代谢途径。使用GLCNAC_2作为指标的β-1,4结合降解活性，从KOD1菌株的无细胞提取物中部分纯化N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶（Nagase），并通过主动染色鉴定靶蛋白。在N末端氨基酸序列中发现了相应的基因。该基因编码由2,358个碱基和786个氨基酸残基组成的蛋白质，其中大约四分之一的N末端侧显示与β-半乳糖苷酶的同源性，而其余的四分之三则与原始细菌的未知功能性蛋白质以外的蛋白质没有任何同源性。该基因在大肠杆菌中表达，纯化的重组剂显示为exo-β-d-glucosamidase（TK-GLM），与期望相反，它降解了GlcNAC_2，但并未降解GlcNAC_2，但并未降解脱糖基化的Glcn__2。假定在无细胞提取物中观察到的Nagase活性是由脱乙酰基酶和TK-GLM之间的两步反应引起的，这表明存在新的几丁质代谢途径。 TK-GLM是由90 kDa亚基组成的同型二聚体，反应的最佳pH和温度分别为6.0和80°C。 TLC对壳聚糖寡糖及其还原产物的分析表明，该酶是一种外的酶，从单糖单元中寡糖的非还原端水解。该酶是第一个鉴定为Exo-β-D-葡萄糖酰胺酶的基因。目前，总结了这项研究结果的论文已提交给学术期刊。

项目成果

全 崇鍾, 藤原 伸介, 高木 昌宏, 田中 丈士, 今中 忠行: "Tk-PTP, protein tyrosine/serine phosphatase from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 : enzymatic characteristics and identification of its substrate proteins"Biochemical and Biophysical Research Co

Takashi Zen、Shinsuke Fujiwara、Masahiro Takagi、Takeshi Tanaka、Tadayuki Imanaka：“Tk-PTP，来自超嗜热古菌 Thermococcus kodakaraensis KOD1 的蛋白质酪氨酸/丝氨酸磷酸酶：酶学特征及其蛋白质底物的鉴定”生化和生物物理研究公司