ヘキソサミン経路を介し糖尿病合併症の発症に関わる遺伝子群の同定と調節機構の解明

通过己糖胺途径鉴定参与糖尿病并发症发生的基因组并阐明调控机制

• 批准号: 13204010
• 负责人: 横手 幸太郎
• 金额: $ 2.62万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13204010/
• 关键词: 糖尿病; 合併症; プロモーター; 転写因子; ヘキソサミン経路; グルコサミン; 血管平滑筋細胞; DNAチップ

我々はこれまでの研究から、ラットオステオポンチン(以下OPN)遺伝子の5'プロモーター領域にグルコース・グルコサミン反応性領域(以下GGRE)が存在することを見出している。今回、その構造機能連関を明らかにするため、OPNプロモーター領域のdeletion constructsを順次培養平滑筋細胞へ導入してルシフェラーゼレポーターアッセイを行なった。その結果、-112から-62bpの領域にGGREの存在が示唆された。その構造はマウスやヒトOPNプロモーターにも保存され、既知のコンセンサスモチーフを複数含有していた。このうち、E-boxあるいはGC-richモチーフに変異を導入すると、高グルコースやグルコサミンによる転写活性の上昇が著しく損なわれた。このGGREモチーフを有する標識オリゴヌクレオチドを作製しゲルシフトアッセイを行なったところ、既知の転写因子であるUSF-1/2のほか未同定蛋白が結合することがわかった。また治療的介入を視野に入れた検討として、HMG-CoA還元酵素阻害剤(以下スタチン)を培養平滑筋細胞に添加すると、濃度依存的に高グルコースによるOPN発現が蛋白レベル・mRNAレベルで著しく低下した。スタチンによるOPN発現抑制効果は、メバロン酸やゲラニルゲラニルピロリン酸(以下GGP)の添加によりほぼ完全にレスキューされた。したがって、内因性コレステロール合成経路からGGPが産生され、その結果何らかの細胞内蛋白が修飾されることでOPN発現がポジティヴに制御されていると推察された。そのシグナル伝達経路の詳細については、現在解析中である。ストレプトゾトシン惹起糖尿病ラットでは大動脈および腎においてOPNmRNAが過剰発現するが、in vivoでも、スタチンを経口投与すると、これを対照のレベルまで低下させることができた。このほかDNAチップを用い、低濃度グルコサミン負荷により平滑筋細胞内で発現変化の見られる複数の遺伝子を同定した。現在クラスター解析を行っている。

从以前的研究中，我们发现，大鼠骨桥蛋白（OPN）基因的5'启动子区域存在葡萄糖 - 葡萄糖反应区（GGRE）。为了阐明结构和功能键，将OPN启动子区域的缺失构建体依次引入培养的平滑肌细胞中，以执行荧光素酶报告基因测定。结果表明该区域中存在GGRE，从-112到-62bp。该结构在小鼠和人类OPN启动子中也保守，并包含多个已知共识基序。其中，当将突变引入E-Box或GC富基序中时，由于高葡萄糖和葡萄糖胺而引起的转录活性的增加显着受损。制备了携带此GGRE基序的标记的寡核苷酸，并进行了凝胶转移测定，发现身份不明的蛋白质以及已知的转录因子USF-1/2被结合。此外，考虑到治疗干预的目的，当将HMG-COA还原酶抑制剂（他汀类药物）添加到培养的平滑肌细胞中时，高葡萄糖引起的OPN表达在蛋白质和mRNA水平下以浓度依赖性方式显着降低。他汀类药物对抑制OPN表达的影响几乎通过添加甲戊酸酯和黄烷基凝血酶磷酸（以下称为GGP）完全挽救了。因此，据估计，GGP是由内源性胆固醇合成途径产生的，结果，一些细胞内蛋白被修饰，从而积极控制OPN表达。信号通路的详细信息目前正在分析中。 OPN mRNA在链蛋白酶诱导的糖尿病大鼠的主动脉和肾脏中过表达，但是在体内，汀类药物的口服也可以将其降低为对照水平。另外，由于低浓度的葡萄糖负荷，DNA芯片用于鉴定平滑肌细胞内表达变化的多个基因。当前执行集群分析。

项目成果

宮澤恵二, 他: "新細胞増殖因子のバイオロジー"羊土社(東京). (2001)

Keiji Miyazawa 等人：“新细胞生长因子的生物学”Yodosha（东京）（2001 年）。

横手幸太郎: "PDGFの生理機能と疾患治療への応用"Molecular Medicine. 38. 250-258 (2001)

Kotaro Yokote：“PDGF的生理功能及其在疾病治疗中的应用”《分子医学》38。250-258（2001）。

Takemoto M, et al.: "NK-104, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor, reduces osteopontin expression by rat aortic smooth muscle cells"Br J Pharmacol. 133. 83-88 (2001)

Takemoto M 等人：“NK-104 是一种 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶抑制剂，可减少大鼠主动脉平滑肌细胞的骨桥蛋白表达”Br J Pharmacol。

Mori S, et al.: "Enhanced intra-abdominal visceral fat accumulation in patients with Werner syndrome"Int J Obesity Relat Metab Dis. 25. 292-295 (2001)

Mori S 等人：“沃纳综合征患者腹内内脏脂肪堆积增强”Int J Obesity Relat Metab Dis。

Asaumi S: "Identification and characterization of high glucose and glucosamine responsive element in rat osteopontin promoter"Eur J Clin Invest. (in press).

Asaumi S：“大鼠骨桥蛋白启动子中高葡萄糖和葡萄糖胺反应元件的鉴定和表征”Eur J Clin Invest。