神経細胞の極性形成を担う分子群の網羅的解析

全面分析负责形成神经元极性的分子群

• 批准号: 13206049
• 负责人: 稲垣 直之
• 金额: $ 3.52万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206049/
• 关键词: 神経細胞; 極性; 軸索; 樹状突起; CRMP-2; プロテオミクス; 2次元電気泳動; 微小管

我々は、細胞内蛋白質CRMP-2が海馬培養神経細胞の軸索に濃縮することを見いだした。また、CRMP-2を神経細胞に外来性に高レベル発現させると、神経極性に乱れが生じ通常は1本しか形成されない軸索が複数形成された(Inagaki et al. Nature Neurosci.4,872-873,2001)。以上の結果はCRMP-2が神経細胞の軸索形成と極性形成に重要な役割をはたす可能性を示唆する。そこで、CRMP-2による神経細胞の軸索形成と極性形成機構の解明のためにCRMP-2と相互作用する蛋白質をアフィニティーカラム法およびyeast two-hybrid法を用いて網羅的にスクリーニングした。その結果、チューブリンが同定された。そこで、CRMP-2の欠失変異体を用いて微小管とのcosediment assayをおこない、少なくともCRMP-2の323番目から381番目のアミノ酸の部分が微小管との結合に寄与することが明らかとなった。次にCRMP-2がチューブリンあるいは微小管に結合することによって、微小管の動態にどのような作用を及ぼすかについて、暗視野顕微鏡を用いて調べた。その結果、微小管に結合するフラグメントおよび全長のCRMP-2が微小管の重合を促進することがわかった。一方、微小管に結合しないフラグメントは微小管の重合を促進しなかった。また野生型のCRMP-2は神経細胞の突起形成を促進したが、チューブリン結合部位を欠くCRMP-2は神経突起形成を促進しなかった。以上のことから、神経軸索形成や極性形成CRMP-2とチューブリンとの相互作用が関与する可能性が示唆された。また、CRMP-2結合蛋白質をさらに網羅的に同定するために2次元電気泳動法の改良を試みた。14枚のラージゲルを組み合わせて電気泳動を行うことにより、原理的に1万個以上の蛋白スポットを検出することが可能となった(Oguri, et al. Proteomics, in press)。

我们发现细胞内蛋白CRMP-2富含海马培养神经元的轴突。此外，当在神经元中外源表达CRMP-2时，神经极性会受到干扰并形成多个轴突，通常仅形成一个轴突（Inagaki等人自然神经科学，4,872-873,2001）。上述结果表明，CRMP-2在神经元轴突形成和极性形成中可能起重要作用。因此，为了阐明CRMP-2神经元的轴突形成和极性形成的机制，使用亲和力柱和酵母两杂化方法对与CRMP-2相互作用的蛋白质进行了全面筛选。结果，鉴定了微管蛋白。因此，使用CRMP-2的缺失突变体使用微管进行了cose剂测定，并揭示了至少在323至381位的CRMP-2的氨基酸部分有助于与微管结合。接下来，使用黑场显微镜，我们研究了CRMP-2如何与微管蛋白或微管结合，以及它如何影响微管的动力学。结果表明，微管结合的片段和全长CRMP-2促进了微管聚合。另一方面，未与微管结合的片段不会促进微管聚合。此外，野生型CRMP-2促进了神经元突出的形成，而CRMP-2缺乏小管蛋白结合位点并未促进神经突的形成。以上表明，可能涉及神经轴突形成与极化CRMP-2与微管蛋白之间的相互作用。此外，我们试图改善二维电泳方法，以进一步全面鉴定CRMP-2结合蛋白。通过结合14个大凝胶并进行电泳，原则上可以检测到10,000多个蛋白质斑点（Oguri等人，蛋白质组学，印刷中）。

项目成果

Oguri, T., et al.: "Proteome analysis of rat hippocampal neurons by multiple large gel two-dimensional electrophoresis"Proteomics. (印刷中). (2002)

Oguri, T., 等人：“通过多次大凝胶二维电泳对大鼠海马神经元进行蛋白质组分析”蛋白质组学（2002 年出版）。

稲垣直之: "高解像度ラージゲルを用いた二次元電気泳動法による細胞内発現蛋白質の網羅的検出"実験医学. 21(1). 85-88 (2002)

Naoyuki Inagaki：“使用高分辨率大凝胶进行二维电泳综合检测细胞内表达的蛋白质”21(1) (2002)。

深田優子, 稲垣直之, 貝淵弘三: "神経細胞の極性:神経軸索と樹状突起の運命決定"細胞工学. 52(3). 230-234 (2001)

Yuko Fukada、Naoyuki Inagaki、Kozo Kaibuchi：“神经元的极性：神经轴突和树突的命运决定”细胞工程 52(3)。

稲垣直之, 貝淵弘三: "CRMP-2は海馬神経細胞の軸索形成を誘導する"細胞工学. 20(10). 1408-1409 (2001)

Naoyuki Inagaki、Kozo Kaibuchi：“CRMP-2 诱导海马神经元的轴突形成”细胞工程 20(10) 1408-1409 (2001)。

稲垣直之, 貝淵弘三: "神経細胞の軸索および極性形成の分子機構"生体の科学. 52(3). 230-234 (2001)

Naoyuki Inagaki，Kozo Kaibuchi：“神经细胞轴突和极性形成的分子机制”生物科学 52(3) (2001)。