幼若ラット培養海馬ニューロンの可塑的シナプスにおける可視化BDNF分子の動態

培养幼鼠海马神经元塑料突触中 BDNF 分子动力学的可视化

• 批准号: 13210082
• 负责人: 山田 雅司
• 金额: $ 5.06万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13210082/
• 关键词: 脳由来神経栄養因子(BDNF); ニューロトロフィン; シナプス可塑性; カルシウム(Ca^<2+>); ホスホリパーゼCγ(PLCγ); グルタミン酸; グルタミン酸トランスポーター; IP_3

我々は、蛍光蛋白質GFPと脳由来神経栄養因子(BDNF)の融合蛋白質(BDNF-GFP)を長期的に安定発現させた培養海馬ニューロンを用いて、BDNF-GFPが神経活動依存的にスパイン近傍から放出される様子を観察することに成功した。この結果、BDNFがシナプス機能を亢進すべくスパイン近傍から放出される可能性を示した。今回我々は、この放出されたBDNFがどの様なシナプス機能に関与するか、その可能性としてラット培養中枢ニューロンにおける興奮性神経伝達物質グルタミン酸の放出および同期的Ca^<2+>オシレーションに対する影響に着目し解析を行った。ラット海馬、大脳皮質および小脳から培養したニューロンを用いて解析を行った結果、BDNFが急速にグルタミン酸を放出させることを見いだした。さらに、このBDNFによるグルタミン酸放出は、PLCγの阻害剤U73122、細胞内Ca^<2+>貯蔵器官のCa^<2+>を枯渇させるthapsigargin、IP_3受容体の阻害剤xestospongin Cにより抑制されることを見いだした。このことは、このグルタミン酸放出がPLCγ/IP_3を介した細胞内Ca^<2+>貯蔵器官からのCa^<2+>放出により引き起こされることを示唆している。また我々は、BDNFによるこの放出がグルタミン酸トランスポーターの阻害剤であるL-trans-2,4-PDCおよびDL-threo-β-benzyloxyaspartateにより抑制されることを見いだした。この結果は、通常のエキソサイトーシスではなくグルタミン酸トランスポーターの逆転輸送がこの放出過程に関与する可能性を示している。また我々は、培養大脳皮質ニューロンにおいて、ニューロンネットワークの成熟に伴い観察される自発的で同期的なCa^<2+>オシレーションにおけるその頻度が、BDNFにより増強されることを見いだした。さらに、このBDNFによるオシレーションの増強作用にもPLCγ/IP_3を介した細胞内Ca^<2+>貯蔵器官からのCa^<2+>放出およびグルタミン酸トランスポーターの逆転輸送が関与していることを見いだした。以上の結果は、BDNFがPLCγ/IP_3/細胞内Ca^<2+>経路の活性化、そしてそれに伴うグルタミン酸トランスポーターを介したグルタミン酸放出により神経伝達機能を増強する可能性を示している。

我们已经成功地观察了使用培养的海马神经元以神经活性依赖性方式从脊柱附近释放BDNF-GFP，这些神经元具有长期稳定的融合蛋白GFP的稳定表达，并且在神经蛋白（BDNF-GFP）中具有长期的融合蛋白GFP和脑源性神经营养因子（BDNF-GFP）（BDNF-GFP）（BDNF-GFP）。这表明BDNF可以从脊柱附近释放以增强突触功能的可能性。我们分析了该释放的BDNF的突触功能的类型，以及对培养大鼠中心神经元中兴奋性神经递质谷氨酸和同步CA^<2+>振荡的潜在影响。使用从大鼠海马，脑皮质和小脑培养的神经元进行分析，发现BDNF迅速释放出谷氨酸。此外，我们发现BDNF释放的谷氨酸被PLCγ的抑制剂U73122抑制，Thapsigargin的抑制剂U73122在细胞内Ca^<2+>>“储存器器官”中耗尽了Ca^<2+>，ca^<2+>在ca^<2+>中抑制了ca^<2+>，并且是Xestospospons c，XestospOndOmpon c，Xestospongin C，Xestospongin c，IP_3受体的抑制剂。这表明该谷氨酸释放是由PLCγ/IP_3介导的Ca^<2+>从细胞内Ca^<2+>储层器官释放引起的。我们还发现，L-Trans-2,4-PDC和DL-threo-β-苯甲酰氧甲氧甲酸酯，谷氨酸转运蛋白的抑制剂抑制了BDNF的释放。该结果表明，在此释放过程中可能涉及谷氨酸转运蛋白而不是正常胞吐作用的反向转运。我们还发现，BDNF增强了在培养的皮质神经元中神经元网络成熟观察到的自发和同步Ca^<2+>振荡的频率。此外，我们发现BDNF的这种增强的振荡效应与细胞内Ca^<2+>通过PLCγ/IP_3抗谷氨酸转运蛋白的反转转运有关。这些结果表明，BDNF可以通过激活PLCγ/IP_3/细胞内Ca^<2+>途径和相关的谷氨酸通过谷氨酸转运蛋白来增强神经递质功能的可能性。

项目成果

沼川 忠広: "Brain-derived Neurotrophic Factor-induced Potentiation of Ca2+ Oscillations in Developing Cortical Neurons"Journal of Biological Chemistry. 277・8. 6520-6529 (2002)

Tadahiro Numakawa：“脑源性神经营养因子诱导的皮质神经元振荡增强”生物化学杂志 277・8（2002 年）。

山田 雅司: "Analysis of tyrosine phosphorylation-dependent protein-protein interactions in TrkB-mediated intracellular signaling using modified yeast two-hybrid system"Journal of Biochemistry. 130・1. 157-165 (2001)

Masashi Yamada：“使用改良酵母双杂交系统分析 TrkB 介导的细胞内信号传导中酪氨酸磷酸化依赖性蛋白质-蛋白质相互作用”《生物化学杂志》130・1（2001）。