異物排出システム群の連携作動の解析と多剤耐性緑膿菌感染症克服への応用

异物排泄系统协同运作分析及其在克服多重耐药铜绿假单胞菌感染中的应用

• 批准号: 13226122
• 负责人: 後藤 直正
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226122/
• 关键词: Pseudomonas aeruginosa; 排出ポンプ; 異物排出; 遺伝子発現; Mex; RND; 外膜タンパク質; 基質認識

本研究は緑膿菌のマルチコンポーネント型異物排出システム作動の分子機構および発現機構を明らかにすることにより、排出システム阻害薬の創製のみならず、抗菌薬によらない新規化学療法の展開を目指すものである。ゲノム配列から翻訳したアミノ酸配列のin silico解析を基にオリゴペプチドを合成し、ウサギポリクロナル抗体を作成した。それらの特異性は排出システム・ホモログ発現プラスミドから発現したタンパク質と抗体との反応性から確認した。こうして、5種のRNDコンポーネント・ホモログおよび3種の外膜コンポーネント・ホモログ特異抗体を作成した。これらの抗体でLブロスなどの培地で増殖した実験室株PA01での発現を調べたところ、5種類のホモログの発現は検出限界以下であった。一方、既知排出システムのうち、MexXY/OprMおよびMexCD-OprJはLブロスなどでは発現していないが、抗菌薬も含めた異物の添加によって適応的に発現することが分かった。一方、排出システム・ホモログのノックアウトは抗菌薬感受性や蛍光基質に対する排出活性に影響を与えなかった。しかし、排出システム・ホモログのコンポーネント遺伝子の発現プラスミドを用いて、既知の排出システムとのキメラシステムを構築したところ、明らかな排出活性が観察された。こうしてホモログの排出機能が明らかになった。さらに臨床分離緑膿菌のゲノムDNAを鋳型にして、mexD遺伝子をPCR増幅によりクローン化し、プラスミド・ライブラリーを構築した。それらをMexC-OprJ発現株への導入により基質特異性変異体を検索し、基質域拡張型のMexD変異体を得た。この変異体遺伝子の塩基配列の解析および部位特異的変異導入実験からRNDコンポーネントによる基質認識は、ペリプラスムループで起こっていることが示唆された。

This study aims to clarify the molecular mechanism and development mechanism of Pseudomonas aeruginosa's production and excretion of foreign substances, and to develop new methods for chemotherapy. In order to prepare the antibody, we need to select the antibody based on the analysis of silica. The specificity of the antibody is determined by the specificity of the antibody. 5 kinds of RND protein and 3 kinds of outer membrane protein were produced. The antibody was detected in the culture medium and the expression of PA01 was detected in the culture medium and the expression of 5 kinds of PA01 was detected in the culture medium. In one aspect, it is known that MexXY/OprM and MexCD-OprJ can be found in the presence of antibacterial agents containing foreign substances. A prescription, discharge system, discharge system. In addition to the above, the exhaust system of the exhaust system The discharge function of this machine is clear. The DNA of Pseudomonas aeruginosa isolated in clinical practice was typed and amplified by PCR. In addition, MexC-OprJ was found to be able to express stroma specific variants and stroma domain expansion variants. The analysis of the nucleotide sequence of the variant gene and the site-specific variant introduction are carried out in the context of substrate recognition, selection and selection.

项目成果

後藤直正: "耐性菌シリーズ(6)MDR"感染症. 31. 35-44 (2001)

Naomasa Goto：“耐药细菌系列（6）MDR”传染病。 31. 35-44 (2001)

Kiyomi Okamoto et al.: "Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics : Penem resistance mechanisms and their interplay"Antimicrob. Agents Chemother.. 45. 1964-1971 (2001)

Kiyomi Okamoto 等人：“铜绿假单胞菌显示出对培南类抗生素的高度内在耐药性：培南类抗生素耐药机制及其相互作用”Antimicrob。

Hyunjoo Pai et al.: "Carbapenem resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates."Antimicrob.Agents Chemother.. 45. 480-484 (2001)

Hyunjoo Pai 等人：“铜绿假单胞菌临床分离株中的碳青霉烯类耐药机制。”Antimicrob.Agents Chemother.. 45. 480-484 (2001)

後藤直正: "薬剤耐性とエフラックスポンプ"臨床検査. 45. 779-782 (2001)

Naomasa Goto：“耐药性和外排泵”临床检查。45. 779-782 (2001)。

Nobuhisa Masuda et al.: "Hypersusceptibility of the Pseudomonas aeruginosa nfxB mutant to β-lactams due to reduced expression of AmpC β-lactamase"Antimicrob. Agents Chemother.. 45. 1284-1286 (2001)

Nobuhisa Masuda 等人：“由于 AmpC β-内酰胺酶表达减少，铜绿假单胞菌 nfxB 突变体对 β-内酰胺过度敏感”Antimicrob Agents Chemother.. 45. 1284-1286 (2001)