パーオキシナイトライトによるシトクロムC修飾作用のアポトーシス様細胞死への関与

过氧亚硝酸盐对细胞色素 C 的修饰参与凋亡样细胞死亡

• 批准号: 13771417
• 负责人: 中川 秀彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: National Institute of Radiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771417/
• 关键词: パーオキシナイトライト; シトクロムc; アポトーシス; ミトコンドリア; チロシンニトロ化; カスパーゼ; 活性酸素種; 蛋白質修飾

1.パーオキシナイトライト処理による細胞内カスパーゼ経路活性化能の検討前年度にin vitroにおけるカズパーゼ-3の活性化について免疫ブロッティング法を用いて解析し、パーオキシナイトライト処理シトクロムcではカスパーゼ-3活性化能が低下していることを見いだした。本年度は神経膠芽腫培養細胞にパーオキシナイトライトを作用させた場合のカスパーゼ-3および上流経路の活性化の有無を免疫ブロッティング法、蛍光性擬似基質の切断活性により検討した。細胞生存率はパーオキシナイトライト濃度依存的に減少したにも関わらず、持続的なパーオキシナイトライト処理によりカズパーゼ-3および-9活性化が抑制されることが示された。また、短時間のパーオキシナイトライト処理ではアポトーシスが進行することが示された。これによりin vitro系に対応する現象が培養細胞系でも観察されたことになる。2.パーオキシナイトライト処理による培養細胞内シトクロムcの修飾反応の解析前年度の検討において、パーオキシナイトライト処理によってラット神経膠芽腫培養細胞内の12〓14kDa付近の蛋白質がニトロ化されることが明らかとなった。培養細胞のパーオキシナイトライト処理によって実際に細胞内のシトクロムcがニトロ化されるか否かを免疫沈降法を用いて検討したところ、パーオキシナイトライト処理により細胞内でシトクロムcがニトロ化されることが示された。さらにin vitro系でニトロ化されたシトクロムcを加水分解し修飾部位を検討したところ、Trp59およびTyr67を含むペプチド断片に変化が観察された。3.無処理シトクロムcを添加した場合のカスパーゼ-3活性化能回復の可能性についての検討パーオキシナイトライト処理神経膠芽腫細胞から細胞抽出液を調整しシトクロムcを添加してカスパーゼ-3活性化能が回復するかを検討したが、活性化は観察されなかった。

1. パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ る intracellular カ ス パ ー ゼ 経 road can activation の 検 for annual に in before Vitro に お け る カ ズ パ ー ゼ - 3 の activeness に つ い て immune ブ ロ ッ テ ィ ン を グ method with い て analytical し, パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard シ ト ク ロ ム c で は カ ス パ ー ゼ - 3 low activation can が し て い る こ と を see い だ し た. This year は god 経 rubber buds swell culture cell に パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト を role さ せ た occasions の カ ス パ ー ゼ - 3 お よ び upper 経 road の activeness の presence of を immune ブ ロ ッ テ ィ ン グ method, quasi の matrix to cut off the sex 蛍 light active に よ り beg し 検 た. Cell survival は パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト concentration dependent に reduce し た に も masato わ ら ず, hold 続 な パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ り カ ズ パ ー ゼ - 3 お よ び - 9 activeness が inhibit さ れ る こ と が shown さ れ た. ま た, short time の パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard で は ア ポ ト ー シ ス が for す る こ と が shown さ れ た. <s:1> れによ に in vitro is に against 応する phenomenon が cultured cell line で 観 観 observe された とになる とになる とになる. 2. パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ る culture cells シ ト ク ロ ム c の modified reverse 応 の before parsing annual の beg に 検 お い て, パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ っ て ラ ッ ト god 経 glue の 12 〓 buds swell develop cell pay nearly の 14 kda protein が ニ ト ロ change さ れ る こ と が Ming ら か と な っ た. Cultured cells の パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ っ て be interstate に intracellular の シ ト ク ロ ム c が ニ ト ロ change さ れ る か no か を を immune sink method using い て beg し 検 た と こ ろ, パ ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 Richard に よ り intracellular で シ ト ク ロ ム c が ニ ト ロ change さ れ る こ と が shown さ れ た. さ ら に the in vitro system で ニ ト ロ change さ れ た シ ト ク ロ ム c を hydrolytic decomposition し modified parts を beg し 検 た と こ ろ, Trp59 お よ び Tyr67 を containing む ペ プ チ ド fragment に variations change が 観 examine さ れ た. 3. No 処 Richard シ ト ク ロ ム c を add し た occasions の カ ス パ ー ゼ possibility - 3 activation can reply の に つ い て の beg パ 検 ー オ キ シ ナ イ ト ラ イ ト 処 reason god 経 rubber buds swell cells か ら cell extract を adjustment し シ ト ク ロ ム c を add し て カ ス パ ー ゼ - 3 activation can reply す が る か を beg し 検 た が, active は 観 examine さ れ な か っ Youdaoplaceholder0.

项目成果

Nakagawa, H., et al.: "Functional modification of cytochrome c by peroxynitrite in an electron transfer reaction"Chem. Pharm. Bull.. 49. 1547-1554 (2001)

Nakakawa, H., et al.：“电子转移反应中过氧亚硝酸盐对细胞色素 c 的功能修饰”Chem。

Nakagawa, H., et al.: "Dose-and time-dependence of radiation-induced nitric oxide formation in mice as quantifies with electron paramagnetic resonance"Nitric Oxide. 5. 47-52 (2001)

Nakakawa, H. 等人：“通过电子顺磁共振进行量化，小鼠中辐射诱导的一氧化氮形成的剂量和时间依赖性”一氧化氮。

Nakagawa, H., et al.: "Dose-and time-dependence of radiation-induced nitric oxide formation in mice as quantified with electron paramagnetic resonance"Nitric Oxide. 5. 47-52 (2001)

Nakakawa, H. 等人：“通过电子顺磁共振定量，小鼠中辐射诱导的一氧化氮形成的剂量和时间依赖性”一氧化氮。