昆虫脳からの概日リズム調節ペプチド・PDFの単離・精製

昆虫脑昼夜节律调节肽/PDF的分离纯化

• 批准号: 13780467
• 负责人: 野瀬 健
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780467/
• 关键词: PDF; 概日リズム; 昆虫; 精製

近年、生物時計の研究が進み、その分子機構解明のために様々な種の生物において、概日リズムに関するタンパク質、遺伝子解析が実施されている。こうしたなか、18アミノ酸残基からなる神経ペプチド・PDHは、昆虫脳における時計ニューロンに特異的に存在し、概日リズム発現のペースメーカーホルモンとして働いている。このペプチドは神経軸索、シナプス、細胞質のみならず細胞核にも存在し、その機能に大きな注目が寄せられている。しかしながら、受容体をはじめ、分子挙動に関する分析はほとんど手付かずの状態である。本研究では、PDFの分子機構の解析を目的に、以下の実験を行なった。前年度に引き続き、カイコPDFについて精製実験を実施した。脳からの抽出物について固相抽出、逆相HPLCで分画を行なった。同定には抗体を用いたELISA法を用いた。HPLCでの分離後、マススペクトルおよびプロテインシーケンサーでの配列解析を実施したが、PDF全構造は解析できなかった。そこで、まずPDFペプチドの標準品として配列既知のPDFペプチドを化学合成し、その精製時における挙動と構造について検討した。ペプチドはFmoc固相合成法で化学的に合成し、純品を得た。その結果、PDFのN末端に存在するAsn-Gly配列は、ペプチド合成時に不安定であることが明らかとなり、単離・精製時に分解を受ける可能性が示唆された。この事実より、PDFのアミノ酸配列を決定するため、cDNAクローンニング法を用いることとした。その結果、イエバエおよびコオロギPDFの2種をPDFペプチドのアミノ酸配列を決定した。それらの配列情報より相当するペプチドを化学合成し、CDスペクトル測定したところ、リン酸水溶液中ではβシート構造を、膜環境に類似した結果を与えるTFE濃度を増加させるとPDFペプチドの2次構造がαヘリックス構造を多く含む立体構造に変化することが観測された。CDスペクトル解析の結果は2つのPDFでほぼ同一で、受容体結合構造はPDFペプチドに共通であると推定された。

In recent years, the study of biochronology has made progress, and the molecular mechanism of biochronology has been clarified. In the case of insects and insects, the presence of acid residues in the brain and PDH is specific, and the occurrence of acid residues in the brain and PDH in the body is generally observed. These cells are located in the axons, cytoplasm, nucleus, and function. The analysis of the state of the receptor and the molecular motion is carried out by hand. This study aims to analyze the molecular structure of PDF. Last year, the company introduced Solid phase extraction, reverse phase HPLC, and separation. The same method was used to determine the antibody. After HPLC separation, column analysis and PDF structural analysis were carried out. The standard of PDF is prepared by chemical synthesis and purification. Fmoc solid phase synthesis method for chemical synthesis, pure product As a result, the presence of Asn-Gly alignment at the N-terminal of PDF indicates the possibility of instability during synthesis and decomposition during purification. This is the first time I've ever seen one of these. 2 kinds of PDF files are selected from the PDF file. For example, if the concentration of TFE in aqueous solution is higher than that in aqueous solution, the concentration of TFE in aqueous solution is higher than that in aqueous solution. The result of CD selection analysis is the same as that of PDF selection, and the receptor combination structure is the same as PDF selection.

项目成果

Ayami Matsushima et al.: "Structural Characterization of the Housefly PDF, A Circadian Rhythm Pacemaker Hormone"Peptide Science 2002. (印刷中). (2003)

Ayami Matsushima 等人：“家蝇 PDF 的结构特征，昼夜节律起搏激素”肽科学 2002 年。（出版中）。

Y.Chuman et al.: "cDNA Cloning of Circadian Rhythm Pacemaker Neuropeptide PDF in Gryllus Bimaculatus and its Nuclear Localization"Peptide Science. 2000. 59-62 (2001)

Y.Chuman 等人：“Gryllus Bimaculatus 中昼夜节律起搏器神经肽 PDF 的 cDNA 克隆及其核定位”肽科学。