エニドグリコセラミダーゼ及びそのアクチベーターの反応機構の解明とその応用

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エンドグリコセラミダーゼ(EGCase)はスフィンゴ糖脂質(糖脂質)の糖鎖-セラミド間のグリコシド結合を加水分解する酵素である。EGCaseの一次構造の解析により、Rhodococcus sp. M-777、C9、及びユウレイクラゲ由来EGCaseは糖加水分解酵素ファミリ-5(GH5)と有意な相同性を示すことを明らかにした。また、GH5で活性部位を構築する8つの保存アミノ酸残基に対する点変異導入、および立体構造既知のGH5セルラーゼを鋳型としたホモロジーモデリングにより、EGCaseがGH5に属する酵素と同じ触媒機構を有することを証明した。しかし、EGCaseとセルラーゼの基質特異性は明確に異なる。この違いは両酵素の基質認識部位の違いにあると考え、立体構造モデルの作製、および変異体EGCaseの作製により、EGCaseの基質認識機構の詳細な推定を行った。M-777 EGCase IIの立体構造モデルから、セラミドが結合すると予測されたサブサイトプラス側の基質結合部位には、スタッキング相互作用により糖を認識する芳香族アミノ酸残基がほとんど見出されないことが分かった。また、糖鎖部分に対する基質特異性が異なるC9 EGCaseおよびM-777 EGCase IIのキメラを作製したところ、GH5に属するセルラーゼには見られないEGCase特有の挿入配列が、両EGCaseの基質特異性の違いに寄与することが示された。さらに、このEGCase特異的配列が、糖脂質特異的な糖鎖構造である枝分かれしたシアル酸を認識する基質結合部位を構築していることが予測された。おそらく、EGCaseはセルラーゼと同一の祖先遺伝子を持ち、基質結合部位の構造を変化させることによってスフィンゴ糖脂質を分解する酵素に進化したものと考えられる。