プロテオグリカン生合成におけるデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸の選別

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本研究は、デルマタン硫酸(DS)とコンドロイチン硫酸(CS)の仕分け機構を明らかにすることを目的とし、DS合成に関与するC5エピメラーゼのクローニングを行ない、同酵素の特徴を明らかにする。また、CS/DS同様細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸(HA)にも着目し、その合成阻害機構の解析も行う。1.CS/DSの仕分け機構CS/DS同様グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸(HS)では、そのエピマー化を触媒するC5エピメラーゼが近年明らかになり、これはHSの硫酸転移酵素とゴルジ装置内にて複合体を形成している。そこで、CSでも同様に複合体を形成していることを仮定した。これに基づき、ヒトCS硫酸転移酵素をBaitとし、Yeast Two Hybridを用いたクローニングを行なうためのcDNAライブラリーを作製した。また、C5エピメラーゼのより簡便なアッセイ法を確立する為に、FACSを用いる方法の開発に着手した。まずGAG-リピドを用いたELISAを行ない、この結果、コンドロイチナーゼB処理をした際にCS/DS間にΔDi-4S抗体に対する反応性の差を確認できた。さらに蛍光染色で細胞での検討を行なった結果、ELISA同様CS/DS間の差をコンドロイチナーゼBとΔDi-4S抗体により比較できることがわかった。そこで、細胞表面上のDS分析を行なう為にFACSを行なった。様々な細胞でCS/DSを比較分析した結果、両者の間に差を確認できた。2.HA合成阻害機構の解析4-メチルウンベリフェロン(MU)は、ヒト皮膚線維芽細胞やC型連鎖球菌のヒアルロン酸(HA)合成を阻害することがこれまでに見い出されている。しかしながら、その作用機序に関する情報は極めて少ない。そこで、MUによるHA合成阻害の機構について、HA合成酵素(HAS)の遺伝子導入細胞を用いて解析した。その結果、MU-グルクロン酸の産生増加に伴って、MUの阻害効果が増強することを見い出した。以上の結果から、細胞内在性UDP-糖転移酵素(UGT)の糖転移反応とそれに伴うUDP-グルクロン酸の消費が、HA合成と競合した可能性が考えられた。