放線菌由来ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質の生合成研究

放线菌苯并异色满醌类抗生素的生物合成研究

• 批准号: 02J07991
• 负责人: 田口 貴章
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J07991/
• 关键词: 放線菌; 抗生物質; 立体特異的ケト還元酵素; site directed mutagenesis; Homology modeling; RT-PCR; 立体特異的還元酵素; in vitro assay; 基質チャネリング

立体化学が逆の生成物を与える立体特異的ケト還元酵素RED1・RED2について、反応制御機構を明らかにするためsite directed mutagenesisを行った。RED1の活性中心と予想されるアミノ酸二残基His、Glu、RED2の活性中心と考えられる三残基Ser、Tyr、Lysを他のアミノ酸に置換したmutant RED1/2を発現する遺伝子を、放線菌用発現ベクターpRM5に組み込みプラスミドpIK572-pIK578(RED1、7種)pIK559-pIK564(RED2、6種)を構築した。尚、ここで得られるタンパクのN末にはHis-tag、抗体認識部位、エンテロキナーゼ切断部位が付加されるようデザインした。構築したプラスミド各々を宿主Streptomyces coelicolor CH999に導入し、形質転換体を液体培養後、培地中に蓄積される代謝産物をHPLCにより分析した。アミノ酸を置換していないwild type RED1/2は付加した配列をもたない本来のRED1/2と同程度の還元活性を示し、この系が有効であることが示された。さらにmutant RED 1/2ではいずれも活性が消失あるいは低下したことから、置換したアミノ酸は全て予想通り各酵素の還元活性に必須であることを明らかにした。次に酵素発現を確認するため各形質転換体からタンパクを抽出しSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングにより分析したがRED1/2を確認することはできなかった。しかしながら各形質転換体から抽出したRNAを鋳型にRT-PCRを行ったところ目的のバンドを検出できたため、少なくともmRNAは問題なく転写されていると判断した。反応制御機構についてさらに洞察を得るため、タンパク高次構造及び補酵素NADPHとの結合をHomology modelingにより予測した。両酵素は同一化合物を基質とするにも拘らず、3次元構造だけでなく反応制御機構も大きく異なることが示唆された。上記結果について、現在論文を執筆し投稿準備中である。

Stereo chemical inverse products and stereospecific enzymes RED1 ·RED2 isozymes, anti-site directed mutagenesis products, anti-stereochemical products, stereo products, stereo products and stereospecific enzymes. The active center of RED1 is intended to amplify the two residues of His, Glu and RED2. The three residues of Ser, Tyr, Lys and other residues of Ser, Tyr, and Lys are detected in mutant RED1/2, and the purified pIK572-pIK578 (RED1, 7) pIK559-pIK564 (RED2, 6) are detected by UV-vis pRM5. Still, please tell me that you have to pay for the His-tag, the antibody, the antibody, the cut-off site, the antibody, the antibody and the antibody. After the Streptomyces coelicolor CH999 of the host was incubated, the liquid was cultured, and the HPLC was stored in the culture ground. This is the same as that of the original RED1/2, the same degree of RED1/2, the same degree of meta-activity, and the system has the same level of activity. If you want to know the activity of each enzyme, it is necessary to know that the activity of each enzyme must be determined if you want to know the activity of each enzyme. The activity of mutant RED 1 and 2 should disappear. The secondary enzyme confirmed that the SDS-PAGE was extracted from all shapes and shapes of the body, and that the SDS-PAGE was extracted and analyzed by RED1/2. In this case, you need to extract the RNA type of RT-PCR. The purpose is to make sure that you have a problem, and that you need to write a few questions about your mRNA. The anti-control machine has gained insight into the production of high-quality products and the combination of enzyme NADPH and Homology modeling. The enzyme is the same compound, and the same compound is used in the same compound, and the three-dimensional reaction system is used by the Imperial Palace to show that it is instigated. The results of the last report failed, and the submission preparation for the executive of the article is now in preparation.

项目成果

Takaaki Taguchi: "Structure-function relationship of stereospecific ketoreductases involved in the biosynthesis of benzoisochromanequinone Antibiotics in Streptomyces spp."2003 Annual Meeting of Society for Industrial Microbiology 2003年8月11日ミネアポリス(USA). (

Takaaki Taguchi：“链霉菌中苯并异色满醌抗生素生物合成中涉及的立体特异性酮还原酶的结构-功能关系。”工业微生物学会 2003 年年会，2003 年 8 月 11 日，明尼阿波利斯（美国）。

Takaaki Taguchi: "Structure-function relationship of stereospecific ketoreductase involved in the biosynthesis of benzoisochromanequinune antibiotics in Streptomyces spp."13th International Symposium for Biology of Actinomycetes 2003年12月2日(オーストラリア)メルボルン.

Takaaki Taguchi：“链霉菌中苯并异色满醌抗生素生物合成中涉及的立体特异性酮还原酶的结构-功能关系。”第 13 届国际放线菌生物学研讨会，2003 年 12 月 2 日，澳大利亚墨尔本。

田口 貴章: "ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質の生合成研究(19)-遺伝子破壊体の分析と相補実験によるactVI-ORFAの機能解析-"2003年度(第18回)日本放線菌学会大会 2003年6月26,27日東京. (ポスター発表). 33

Takaaki Taguchi：“苯并异色满醌抗生素的生物合成研究（19） - 通过基因破坏和互补实验分析 actVI-ORFA 的功能 -” 2003 年（第 18 届）日本放线菌学会会议 2003 年 6 月 26 日和 27 日在东京举行（海报）。介绍）33。