放線菌由来ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質の生合成研究

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立体化学が逆の生成物を与える立体特異的ケト還元酵素RED1・RED2について、反応制御機構を明らかにするためsite directed mutagenesisを行った。RED1の活性中心と予想されるアミノ酸二残基His、Glu、RED2の活性中心と考えられる三残基Ser、Tyr、Lysを他のアミノ酸に置換したmutant RED1/2を発現する遺伝子を、放線菌用発現ベクターpRM5に組み込みプラスミドpIK572-pIK578(RED1、7種)pIK559-pIK564(RED2、6種)を構築した。尚、ここで得られるタンパクのN末にはHis-tag、抗体認識部位、エンテロキナーゼ切断部位が付加されるようデザインした。構築したプラスミド各々を宿主Streptomyces coelicolor CH999に導入し、形質転換体を液体培養後、培地中に蓄積される代謝産物をHPLCにより分析した。アミノ酸を置換していないwild type RED1/2は付加した配列をもたない本来のRED1/2と同程度の還元活性を示し、この系が有効であることが示された。さらにmutant RED 1/2ではいずれも活性が消失あるいは低下したことから、置換したアミノ酸は全て予想通り各酵素の還元活性に必須であることを明らかにした。次に酵素発現を確認するため各形質転換体からタンパクを抽出しSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングにより分析したがRED1/2を確認することはできなかった。しかしながら各形質転換体から抽出したRNAを鋳型にRT-PCRを行ったところ目的のバンドを検出できたため、少なくともmRNAは問題なく転写されていると判断した。反応制御機構についてさらに洞察を得るため、タンパク高次構造及び補酵素NADPHとの結合をHomology modelingにより予測した。両酵素は同一化合物を基質とするにも拘らず、3次元構造だけでなく反応制御機構も大きく異なることが示唆された。上記結果について、現在論文を執筆し投稿準備中である。