原形質流動に関与する高等植物ミオシンの1分子レベルでの解析

单分子水平分析参与血浆流的高等植物肌球蛋白

• 批准号: 02J20019
• 负责人: 富永 基樹
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: National Institute of Information and Communications Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J20019/
• 关键词: 原型質流動; ミオシン; 1分子解析; カルシウム; 原形質流動; 単一分子解析; カルシウム制御

ミオシンXIは、Ca^<2+>により運動が阻害される。ミオシンをpCa5.5以上の高濃度のCa^<2+>で処理をすると、軽鎖であるカルモジュリンが解離し、アクチンフィラメントとの相互作用が低下した。この時、ヘッドのATPase活性にほとんど変化は見られなかった。高濃度Ca^<2+>存在下(pCa 4)でも、アクチンに相互作用できるミオシンの数を増やすか、ATP濃度を下げることで、アクチンはミオシン上を連続的に運動できるようになった。これらの結果から、Ca^<2+>による軽鎖CaMの解離が、ミオシンXIのプロセッシブ運動能を低下させることが示唆された。Rigor結合させたアクチンの熱運動による回転からミオシン1分子のねじれ弾性を見積ったところ、Ca^<2+>処理による増加が見られた。この結果は、CaMが解離したネックが短くなることを示唆している。電子顕微鏡による観察から、ミオシンのネック部位がCa^<2+>存在下では約30%短くなっていることが明らかとなった。光ピンセットによる1分子計測より、ミオシンはpCa4でもプロセッシブ運動を示したが、その平均発生力は小さくなり、ステップサイズも24nmに減少していた。また、このステップサイズは負荷依存性があり、低負荷(0-0.5 pN)では27nm、高負荷(0.5-1 pN)では22nmであった。一方、未処理のミオシンXIの35nmステップには負荷依存性は見られなかった。以上より、軽鎖カルモジュリンは、ミオシンに結合することによりネック部位に弾性と長さを与え、大きな歩幅でのプロセッシブ運動に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。高等植物ミオシンXIの速度発生やプロセッシプ運動の機能をより詳細に解析するために、ミオシンXIの発現系を確立し、分子生物学的、構造学的解析を行う。このためにタバコ培養細胞のcDNAライブラリーを作製した。

肌球蛋白XI被Ca^<2+>抑制。用高浓度的Ca^<2+> PCA5.5或更高的Ca^<2+>处理肌球蛋白的轻链钙调蛋白（这是轻链）减少了与肌动蛋白丝的相互作用。目前，头部的ATPase活动几乎没有变化。即使存在高浓度的Ca^<2+>（PCA 4），肌动蛋白也可以通过增加可以与肌动蛋白相互作用或降低ATP浓度的肌球蛋白数量连续地进行肌动蛋白。这些结果表明，通过Ca^<2+>将轻链凸轮解离会降低肌球蛋白XI的加工运动。当通过热运动引起的严格粘结肌动蛋白的旋转估算一个肌球蛋白分子的扭转弹性时，由于CA^<2+>治疗而观察到增加。该结果表明CAM缩短了分离的颈部。使用电子显微镜观察表明，在存在Ca^<2+>的情况下，肌球蛋白的颈部位点短约30％。使用光学镊子测量单分子的测量表明，肌球蛋白还显示出PCA4的加工运动，但平均产生力降低，步骤尺寸降低至24 nm。此外，此步骤大小取决于负载，低负载（0-0.5 pn）为27 nm，高负载（0.5-1 pn）为22 nm。另一方面，在未处理的肌球蛋白XI的35 nm步骤中未观察到载荷依赖性。从上面可以揭示出轻链钙调蛋白通过与肌球蛋白结合来为颈位提供弹性和长度，并且在大步迈进的处理运动中起着重要作用。为了进一步详细分析较高植物肌球蛋白XI的速率产生和加工运动的功能，建立了肌球蛋白XI的表达系统，并进行了分子生物学和结构分析。为此，制备了烟草培养细胞的cDNA库。