Development of a method for structural characterization of DNA-binding proteins with multiple structural domains

开发具有多个结构域的 DNA 结合蛋白的结构表征方法

基本信息

  • 批准号:
    13680700
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.18万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    2001
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2001 至 2002
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

In order to develop a method for structural characterization of DNA-binding proteins with multiple structural domains, chemical cross-linking and mass spectrometry analyses were carried out on a complex of a DNA-binding domain of transcription factor HSF3 and its target protein. After the observation of the molecular ion of the non-covalent protein-protein complex, cross-linking of two amino groups of Lys side chains were performed with BS^3 (bis(sulfosuccinimidyl) suberate). The cross-linked protein complex was isolated by SDS-PAGE, reduced and alkylated, and digested with trypsin in the gel. The digest was analyzed by MALDI-TOFMS and assignment of molecular masses to the sequence was carried out, resulting in the identification of linked Lys residues. With further improvement, this method is promising for the characterization of a protein with multiple structural domains, whose tertiary structure is difficult to be solved with X-ray crystallography or NMR.Expression and purification … More of the full-length HSF3 and TFIIE, transcription factors with multiple structural domains, was carried out. Since the expression level of HSF3 was low with the initial system, several kinds of plasmid and host E. coli were examined. In the case of TFIIE, heterotetramer of two TFIIEα and β, there were difficulties in the expression level (TFIIEα) and in the stability during the purification process (TFIIEβ). The method mentioned above will be applied to these proteins after the establishment of their expression and purification systems.Structural changes on a peptide by the interaction with phospholipids were investigated with hydrogen-deuterium exchange and Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Melittin, a hemolytic peptide isolated from honeybee, was in quite random structure in the absence of lipids while it was in some stable structure in the presence of phospholipids. Different behavior was recognized according to the kinds of phospholipids. This method might be applicable to characterize the structure of membrane-bound proteins. Less
为了建立一种多结构域DNA结合蛋白的结构表征方法,对转录因子HSF 3的DNA结合结构域与其靶蛋白的复合物进行了化学交联和质谱分析。在观察到非共价蛋白质-蛋白质复合物的分子离子后,用BS ^[3](双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)交联赖氨酸侧链的两个氨基。通过SDS-PAGE分离交联的蛋白质复合物,还原和烷基化,并在凝胶中用胰蛋白酶消化。通过MALDI-TOFMS分析消化物,并对序列进行分子量分配,从而鉴定连接的Lys残基。通过进一步改进,该方法有望用于表征具有多个结构域的蛋白质,其三级结构难以用X射线晶体学或NMR解析。表达和纯化 ...更多信息 全长HSF 3和TFIIE,具有多个结构域的转录因子,进行了。由于HSF 3在原系统中的表达水平较低,因此采用多种质粒和宿主菌E.大肠杆菌。在TFIIE(两个TFIIEα和β的异源四聚体)的情况下,在表达水平(TFIIEα)和纯化过程中的稳定性(TFIIEβ)方面存在困难。在建立了这些蛋白的表达和纯化系统后,将上述方法应用于这些蛋白的研究,并利用氢氘交换和傅立叶变换离子回旋共振质谱研究了肽与磷脂相互作用后的结构变化。蜂毒肽是从蜜蜂中分离得到的一种溶血肽,在无脂条件下其结构较为随意,而在磷脂条件下其结构较为稳定。根据磷脂的种类,识别不同的行为。这种方法可能适用于表征膜结合蛋白质的结构。少

项目成果

期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
S. Akashi and K. Takio: "Structure of Melittin bound to Phospholipid Micelles Studied Using Hydrogen-Deuterium Exchange and ESI-FTICR MS"J Am. Soc. Mass Spectrom. 12(12). 1247-1253 (2001)
S. Akashi 和 K. Takio:“使用氢-氘交换和 ESI-FTICR MS 研究了与磷脂胶束结合的蜂毒肽的结构”J Am。
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明石知子: "生命科学のための最新マススペクトロメトリー II-8 タンパク質の相互作用の解析(2) -タンパク質-タンパク質相互作用部位の解析-"原田健一、田口良、橋本豊編、講談社サイエンティフィク. 349(179-199) (2002)
Tomoko Akashi:“生命科学的最新质谱分析 II-8 蛋白质相互作用的分析(2)-蛋白质-蛋白质相互作用位点的分析”,作者:Kenichi Harada、Ryo Taguchi 和 Yutaka Hashimoto,讲谈社科学.349(179-)。 199) (2002)
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明石知子: "生命科学のための最新マススペクトロメトリー II-8 タンパク質の相互作用の解析(2) -タンパク質-タンパク質相互作用部位の解析-"原田健一、田口良、橋本豊編、講談社サイエンティフィク. 349 (2002)
Tomoko Akashi:“生命科学的最新质谱 II-8 蛋白质相互作用的分析 (2) -蛋白质-蛋白质相互作用位点的分析 -”由 Kenichi Harada、Ryo Taguchi 和 Yutaka Hashimoto 编辑,讲谈社科学 .349 (2002)。
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S.Akashi, K.Takio: "Structure of Melittin bound to Phospholipid Micelles Studied Using Hydrogen-Deuterium Exchange and ESI-FTICR MS"Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Vol.12, No.12. 1247-1253 (2001)
S.Akashi、K.Takio:“使用氢-氘交换和 ESI-FTICR MS 研究的蜂毒肽与磷脂胶束结合的结构”美国质谱学会杂志。
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S.Akashi, K.Takio: "Melittin-Diacylphosphatidylcholine Interaction Examined by Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry"Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan. Vol.50, No.2. 67-71 (2002)
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知道了