XAFS法によるエチレンセンサーたんぱく質ETR1のセンサー部位の構造解析

使用 XAFS 方法对乙烯传感器蛋白 ETR1 的传感器位点进行结构分析

• 批准号: 13740385
• 负责人: 菊地 晶裕
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13740385/
• 关键词: 情報伝達たんぱく質; エチレン; ETR1; XAFS; DV-Xα; 情報伝達タンパク質; 銅錯体

本研究で構築したETR1の大量発現系から得られるETR1試料に銅イオンを導入することを試みた。ICP発光分析などではたんぱく質中の銅イオンの存在を確認することはできるが、その銅イオンがspecificな位置に導入されたかどうかの判断ができない。そこで本研究では、X線吸収スペクトルの一種であるXANESスペクトルを理論計算(DV-Xα法)により解析することで、銅イオンの配位環境を明らかにすることにした。この手法は、低分子化合物や材料の分野ではしばしば用いられているが、たんぱく質のような高分子化合物に適応されたことはほとんどない。しかし、本研究でアズリンをはじめとする構造既知の銅たんぱく質を用いて解析を試みたところ、この手法が銅たんぱく質内に存在する銅イオンの配位環境を明らかにするのに非常に適していることが分かった。そこで、培養の際や精製の各段階で銅イオンを加えたETR1試料を調整し、それぞれのXANESスペクトルをDV-Xαにより解析した。その結果、細胞膜を可溶化する際に、界面活性剤とあわせてCuSO_4と還元剤を加えることで、ETR1のspecificな位置に銅イオンが導入されることが分かった。この試料を用いて、本研究の目的であるEXAFS測定・解析を行ったが、濃度の問題によりS/Nの悪いデータしか得られず、EXAFS解析による銅イオン周辺の詳細な構造を決定するには至らなかった。しかしながら、XANESスペクトルではエチレンの有無による変化を観測することに成功し、この変化がETR1に存在する銅イオンにエチレンが配位したことに起因することを、既知化合物のXANESスペクトルや理論解析から明らかにすることができた。このような分光学的な直接的証拠により、ETR1に存在する銅イオンにエチレンが付加することを示すことができたのは本研究が世界で初めてである。

In this study, a large number of ETR1 production systems were constructed to detect the presence of copper in ETR1 samples. ICP light analysis is used to confirm the presence of copper in the sky, and to determine the specific position of copper. In this study, X-ray absorption spectra were analyzed by theoretical calculation (DV-Xα method). This method is used to distinguish between low molecular weight compounds and high molecular weight compounds In this study, the coordination environment of copper in the structure of known copper in the sky was analyzed and analyzed. In addition, the ETR1 sample was adjusted and analyzed during the cultivation and purification of the various stages. As a result, cell membrane solubilization, interfacial activity, ETR1 specific position, ETR1 specific position, etc. The purpose of this study is to determine the S/N ratio and determine the structure of the sample. XANES has been successfully tested for the existence of ETR1, and the theoretical analysis of XANES has been carried out. This study is based on the direct evidence of the existence of ETR1.