XAFS法によるエチレンセンサーたんぱく質ETR1のセンサー部位の構造解析

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本研究で構築したETR1の大量発現系から得られるETR1試料に銅イオンを導入することを試みた。ICP発光分析などではたんぱく質中の銅イオンの存在を確認することはできるが、その銅イオンがspecificな位置に導入されたかどうかの判断ができない。そこで本研究では、X線吸収スペクトルの一種であるXANESスペクトルを理論計算(DV-Xα法)により解析することで、銅イオンの配位環境を明らかにすることにした。この手法は、低分子化合物や材料の分野ではしばしば用いられているが、たんぱく質のような高分子化合物に適応されたことはほとんどない。しかし、本研究でアズリンをはじめとする構造既知の銅たんぱく質を用いて解析を試みたところ、この手法が銅たんぱく質内に存在する銅イオンの配位環境を明らかにするのに非常に適していることが分かった。そこで、培養の際や精製の各段階で銅イオンを加えたETR1試料を調整し、それぞれのXANESスペクトルをDV-Xαにより解析した。その結果、細胞膜を可溶化する際に、界面活性剤とあわせてCuSO_4と還元剤を加えることで、ETR1のspecificな位置に銅イオンが導入されることが分かった。この試料を用いて、本研究の目的であるEXAFS測定・解析を行ったが、濃度の問題によりS/Nの悪いデータしか得られず、EXAFS解析による銅イオン周辺の詳細な構造を決定するには至らなかった。しかしながら、XANESスペクトルではエチレンの有無による変化を観測することに成功し、この変化がETR1に存在する銅イオンにエチレンが配位したことに起因することを、既知化合物のXANESスペクトルや理論解析から明らかにすることができた。このような分光学的な直接的証拠により、ETR1に存在する銅イオンにエチレンが付加することを示すことができたのは本研究が世界で初めてである。