種子貯蔵タンパク質液胞輸送機構の迅速解析システムの構築

种子贮藏蛋白液泡运输机制快速分析系统的构建

• 批准号: 13760066
• 负责人: 丸山 伸之
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760066/
• 关键词: ダイズ; タンパク質貯蔵液胞; 種子貯蔵タンパク質; 細胞内輸送

昨年度、ボンバードメント法による遺伝子導入と落射型蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡観察を組み合わせることにより、GFPを用いたトランジェントアッセイシステムを開発した。そして、本方法によりダイズβ-コングリシニンα'サブユニットのC末端24残基が液胞輸送に重要な働きをしていることを示した。本年度は、さらに詳細な解析を進め、α'サブユニットのC末端10残基が液胞中の区画であるマトリックスへのシグナルとなっていることを明らかにした(Nishizawa et al.,Plant J.,2003,in press)。GFPを用いたアッセイ系に加えて、各種貯蔵タンパク質欠失ダイズに、ダイズ貯蔵タンパク質の遺伝子を導入し、間接蛍光抗体法によって輸送部位を同定するアッセイ系の構築を試みた。この方法を確立することにより、ダイズ種子貯蔵タンパク質の輸送機構をダイズ種子中で詳細に解析することが可能となる。まず、一般的な品種を用いて、内在性のダイズ種子貯蔵タンパク質(グリシニン及びβ-コングリシニン)を間接蛍光抗体法によって検出するための条件(固定時間、固定試薬、グリシニン及びβ-コングリシニンの抗体濃度、蛍光ラベルした二次抗体の濃度、抗体反応時間など)を検討した。その結果、グリシニン及びβ-コングリシニンの両抗体により、両タンパク質の液胞への局在を特異的に検出する条件を確立した。この条件をもとに、グリシニンを欠失しているダイズ種子に、グリシニンの遺伝子をボンバードメント法により導入し、発現タンパク質の検出を試みた。しかし、グリシニンを欠失しているダイズ種子の内在性タンパク質とグリシニン抗体とが非特異的に反応したため、導入したグリシニンの発現を検出できなかった。今後、使用する抗体の最適化を行うことにより、本アッセイ系を完成できるものと考えている。

Last year, ボ ン バ ー ド メ ン ト method に よ る posthumous son 伝 import と fall shot type 蛍 focus light 顕 micro mirror and び レ ー ザ ー 顕 micromirror 観 examine を group み close わ せ る こ と に よ り, GFP を with い た ト ラ ン ジ ェ ン ト ア ッ セ イ シ ス テ ム を open 発 し た. そ し て, this method に よ り ダ イ ズ beta コ ン グ リ シ ニ ン alpha 'サ ブ ユ ニ ッ ト の C terminal 24 residues が vacuole conveying important な に 働 き を し て い る こ と を shown し た. This year は, さ ら に detail analytical を な め, alpha 'サ ブ ユ ニ ッ ト の C terminal 10 residue が の area in the vacuole painting で あ る マ ト リ ッ ク ス へ の シ グ ナ ル と な っ て い る こ と を Ming ら か に し た (Nishizawa et al., Plant J., 2003, in press). Department of GFP を with い た ア ッ セ イ に plus え て, all kinds of storage 蔵 タ ン パ ク qualitative owe lost ダ イ ズ に, ダ イ ズ storage 蔵 タ ン パ ク qualitative の heritage 伝 を import し, indirect light 蛍 antibody technique に よ っ て を transmission parts with fixed す る ア ッ セ イ is の build を try み た. こ の way を establish す る こ と に よ り, ダ イ ズ seed storage 蔵 タ ン パ ク qualitative の transportation agency を ダ イ ズ seed で detailed analytical す に る こ と が may と な る. ま ず, general な varieties を い て, internality の ダ イ ズ seed storage 蔵 タ ン パ ク mass (グ リ シ ニ ン and び beta コ ン グ リ シ ニ ン) を 蛍 indirect light antibody technique に よ っ て 検 out す る た め の conditions (fixed time, fixed try 薬, グ リ シ ニ ン and び beta コ ン グ リ シ ニ ン の antibody concentration, 蛍 light ラ ベ ル し た の secondary antibody density, the antibody against Youdaoplaceholder0 time な た を検 ask for た. そ の results, グ リ シ ニ ン and び beta コ ン グ リ シ ニ ン の struck antibody に よ り, struck タ ン パ ク qualitative の vacuole へ の bureau in を specific に 検 out す を る conditions established し た. こ の conditions を も と に, グ リ シ ニ ン を owe lost し て い る ダ イ ズ seed に, グ リ シ ニ ン の heritage 伝 son を ボ ン バ ー ド メ ン ト method に よ り import し, 発 タ ン パ ク qualitative の 検 try out を み た. し か し, グ リ シ ニ ン を owe lost し て い る ダ イ ズ seed の internality タ ン パ ク qualitative と グ リ シ ニ ン antibody と が nonspecific に reverse 応 し た た め, import し た グ リ シ ニ ン の 発 now を 検 out で き な か っ た. In the future, the use of す る antibody の line optimization を う こ と に よ り, this ア ッ セ を イ department completed で き る も の と exam え て い る.

项目成果

Nishizawa, K., Maruyama, N.et al.: "A C-terminal sequence of soybean β-conglycinin α' subunit act as a vacuolar sorting determinant in seed cells"The Plant Journal. (in press). (2003)

Nishizawa, K., Maruyama, N.等人：“大豆 β-伴大豆球蛋白 α 亚基的 C 末端序列充当种子细胞中的液泡分选决定因素”《植物杂志》（2003 年出版）。