タンパク質貯蔵液胞への選別輸送レセプターのシグナル認識機構の立体構造に基づく解析

基于三维结构的蛋白质选择性转运受体信号识别机制分析

• 批准号: 18780072
• 负责人: 丸山 伸之
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780072/
• 关键词: sorting determinant; receptor; vacuole; glycinin; beta-conglycinin; soybean

タンパク質貯蔵液胞への種子貯蔵タンパク質の輸送機構の全貌を分子レベルで解明する一環として、種子細胞を用いて選別輸送シグナルを解析するシステムを構築し、ダイズ種子貯蔵タンパク質の主要構成成分であるコングリシニンにはC末端型と配列特異型、グリシニンにはC末端型と高次構造型に属する選別輸送シグナルが存在することを明らかにしている。一方、アラビドプシスを用いた解析から、Vacuolar sorting receptor (VSR)とReceptor homology region transmembrane domain ring H2 protein (RMR)と呼ばれる2種類の膜タンパク質がタンパク質貯蔵液胞への選別輸送シグナルに対するレセプターの候補として考えられている。本研究では、ダイズ種子貯蔵タンパク質の3種類の選別輸送シグナルがどのレセプターに認識されるのかを解析するとともに、レセプターの立体構造解析を試みた。レセプター候補分子(ダイズVSRおよびRMR)をダイズ登熟期種子よりクローニングし、それらの内腔領域の組換え型タンパク質を昆虫細胞発現系で調製した。グルタチオンSepharose 4Bを利用したプルダウンアッセイ法および表面プラズモン共鳴法を用いて、選別輸送シグナルとダイズVSRおよびRMRとの相互作用を解析し、C末端型シグナルとダイズVSRとの間に高い親和性があることを明らかにした。さらに、X線結晶構造解析により両者の結合様式を解明するために、組み換え型ダイズVSRの結晶化条件を検索したところ、ポリエチレングリコールを沈殿剤とする条件下において結晶を得ることに成功した。さらに、放射光施設において8-10Å程度の分解能のデータを取得した。VSRの立体構造を決定するために、より良質な結晶化条件の探索を進めている。

As part of elucidating the entire molecular level of the transport mechanism of seed storage proteins into protein storage vacuoles, we have constructed a system for analyzing sorting transport signals using seed cells, revealing that conglycinin, the main components of soybean seed storage proteins, has C-terminal and sequence-specific forms, while glycinin has C-terminal and higher-order conformational forms.另一方面，两种类型的膜蛋白，称为液泡分选受体（VSR）和受体同源性区域跨膜结构域H2蛋白（RMR）被视为选择性传输信号进入蛋白质存储液泡的候选受体。在这项研究中，我们分析了哪些受体识别出三种类型的分类传输信号，例如大豆储存蛋白，并试图分析受体的三维结构。从大豆成熟种子克隆候选受体分子（大豆VSR和RMR），并在昆虫细胞表达系统中制备这些腔内区域中的重组蛋白。分析了使用谷胱甘肽Sepharose 4B和表面等离子体共振的下拉测定法，分析了分类传输信号与大豆VSR和RMR之间的相互作用，揭示了C-末端信号与大豆VSR之间的高亲和力。此外，为了通过X射线晶体结构分析阐明两者之间的结合模式，搜索了重组大豆VSR的结晶条件，并使用聚乙烯甘油作为降水剂在条件下获得了晶体。此外，在同步加速器辐射设施上获得了大约8-10Å的数据。为了确定VSR的三维结构，我们正在继续寻找更好的结晶条件。

项目成果

ダイス種子貯蔵タンパク質の選別輸送シグナルに対するレセプター

大豆种子贮藏蛋白转运信号分选受体

• 发表时间: 2008
• 作者: 丸山 伸之;矢崎 チ晴;Leong Ching Mun;奥田 瑛子;立原 三友紀;内海 成
• 通讯作者: 内海 成

Multiple vacuolar sorting determinants exist in soybean 11S globulin

• DOI: 10.1105/tpc.105.036376
• 发表时间: 2006-05-01
• 期刊: PLANT CELL
• 影响因子: 11.6
• 作者: Maruyama, N;Mun, LC;Utsumi, S
• 通讯作者: Utsumi, S