トランスフェリンによる共同性アニオン結合の構造機構:「ミサイル療法」のためのドラッグデザインの基盤研究として

トランスフェリンによる共同性アニオンの結合機構を解明するため、オボトランスフェリンのNローブに相当するN半分子(1-332に相当)のWild Typeおよびアニオン結合サイト内の残基(Thr117)の変異体(T117G)の発現を行った。発現系の構築はメタノール資化性酵母(P. pastoris)を用いて行い、培地中に分泌された組換タンパク質を、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。Urea-PAGEにより検討した結果、Wild TypeおよびT117G変異体は、天然のものと同様の鉄結合能を持つことが明らかになった。オボトランスフェリンN半分子の変成温度は、鉄イオンが結合したホロ型は、鉄イオンが結合していないアポ型より23℃高く、鉄イオン結合による安定化が起こることが知られている。示差走査熱量分析(DSC)により、組換オボトランスフェリンN半分子の変成温度を測定したところ、アポ型(Wild Type:55.1℃,T117G変異体:54.5℃)、ホロ型(Wild Type:74.7℃,T117G変異体:74.9℃)ともにほぼ同じであり、Thr117が鉄イオン結合による熱安定化に、ほとんど寄与していないことが示唆された。また、組換オボトランスフェリンの立体構造を明らかにするため、Wild TypeおよびT117G変異体の結晶化を、各種スクリーニング試薬を用い、蒸気拡散法により行ったが、結晶構造解析に適した結晶は得られなかった。

トランスフェリンによる共同性アニオンの結合機構を解明するため、オボトランスフェリンのNローブに相当するN半分子(1-332に相当)のWild Typeおよびアニオン結合サイト内の残基(Thr117)の変異体(T117G)の発現を行った。発現系の構築はメタノール資化性酵母(P. pastoris)を用いて行い、培地中に分泌された組換タンパク質を、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。Urea-PAGEにより検討した結果、Wild TypeおよびT117G変異体は、天然のものと同様の鉄結合能を持つことが明らかになった。オボトランスフェリンN半分子の変成温度は、鉄イオンが結合したホロ型は、鉄イオンが結合していないアポ型より23℃高く、鉄イオン結合による安定化が起こることが知られている。示差走査熱量分析(DSC)により、組換オボトランスフェリンN半分子の変成温度を測定したところ、アポ型(Wild Type:55.1℃,T117G変異体:54.5℃)、ホロ型(Wild Type:74.7℃,T117G変異体:74.9℃)ともにほぼ同じであり、Thr117が鉄イオン結合による熱安定化に、ほとんど寄与していないことが示唆された。また、組換オボトランスフェリンの立体構造を明らかにするため、Wild TypeおよびT117G変異体の結晶化を、各種スクリーニング試薬を用い、蒸気拡散法により行ったが、結晶構造解析に適した結晶は得られなかった。