細菌由来のD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素に関する研究

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本申請者は医薬、農薬、食品等の合成原料としての利用が期待されているD-アミノ酸及びその誘導体の酵素的合成法の開発を目的として、自然界よりD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素生産菌の探索を行ってきた。細菌Ochrobactrum anthropi SV3株由来のD-アミノ酸アミダーゼはフェニルアラニンやチロシン等のアミノ酸アミドにD-立体特異的に作用する新規なアミダーゼであることを明らかにしている。本研究では、本酵素をコードする遺伝子を単離し、E.coliを宿主として本酵素の大量発現に成功し、さらに、組換え体より本酵素を精製し、酵素化学的諸性質を明らかにしている。本年度は組換え大腸菌菌体を用いた酵素法によるD-アミノ酸の合成等、応用面での用途開発を検討した。具体的にはD-アミノ酸アミダーゼ高生産組換え大腸菌の培養条件を種々検討し、、本酵素活性産生のための最適条件を設定した。次いで、最適の培養条件で大量培養して得られた菌体を用いて容易に化学合成可能なDL-フェニルアラニンアミドから医薬中間体として有用なD-フェニルアラニンを合成するための反応条件を決定した。さらに、より効率的に目的のD-アミノ酸を生産することを目的として、発現プラスミド上の本酵素遺伝子の領域にランダム変異を導入し、耐熱性が向上した酵素の作製を試みた。ランダム変異導入にはサーマルサイクラーによるerror-prone PCRの手法を用いた。変異酵素のライブラリーより、目的の性質が向上したD-アミノ酸アミダーゼを生産する大腸菌クローンを効率良く選択するためのスクリーニング手法を開発した。得られた変異酵素を組換え大腸菌より単一に精製し、酵素化学的諸性質を野生型酵素と比較した結果、耐熱性とともに触媒活性も上昇していることが明かとなった。変異プラスミドの塩基配列を決定することにより酵素の変異部位を特定し、2個のアミノ酸残基が置換されていることが判明した。そして、変異酵素組換え大腸菌の菌体を用いてDL-フェニルアラニンアミドからのD-フェニルアラニンの効率的な合成を達成した。