微生物のD-アミノ酸アミド加水分解酵素の機能解析と光学活性アミノ酸合成への応用

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D-アミノ酸は医薬品,農薬,食品添加物等の合成中間体として有用な光学活性化合物である。酵素法によるD-アミノ酸及びその誘導体の新たな合成法の開発を目的として,自然界よりD-立体選択的アミノ酸アミド加水分解酵素(D-アミノ酸アミダーゼ)生産微生物の探索を行ってきた。そこから得られたBrevibacterium iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼはリジン,メチオニン,グルタミン,フェニルアラニン等の様々なアミノ酸のアミドのD-体のみを厳密に認識して加水分解する新規なアミダーゼである。さらに,精製したD-アミノ酸アミダーゼの部分アミノ酸配列の情報をもとに,本酵素をコードする遺伝子をクローニングし,大腸菌での発現系を構築している。本研究ではB.iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼを産業的に有用なD-アミノ酸の合成触媒として応用することを目的とした。今年度は,前年度に引き続き,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼを用いたラセミ体アミノ酸アミドのダイナミックな光学分割を検討した。また,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼにランダム変異を導入し,ダイナミックな光学分割にかなう性質(安定性や基質特異性)を持った変異酵素を取得した。さらに,変異遺伝子の塩基配列を決定して,変異部位を同定し,その部位に対してその他のアミノ酸にランダム変異を導入する,いわゆるサチュレーション変異を施し,酵素の性質がさらに向上した変異酵素を取得し,D-アミノ酸合成への応用を検討した。