細菌由来のD-アミノ酸含有ペプチド加水分解酵素に関する研究

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我々は従来よりD-アミノ酸及びその誘導体の酵素的合成法の開発を目的として、自然界よりD-立体特異的ペプチダーゼ生産菌の探索を行ってきた。その中から得られたBacillus cereus DF4-B由来のアルカリD-ペプチダーゼは疎水性の高いD-アミノ酸のオリゴペプチド等にD-立体特異的に作用する新規なペプチダーゼである。このアルカリD-ペプチダーゼはD-アミノ酸含有ペプチドを加水分解するだけでなく、D-アミノ酸メチルエステルを基質とした場合、その加水分解と同時にオリゴマー合成を触媒する。そこで、本研究ではアルカリD-ペプチダーゼをD-アミノ酸含有ペプチド合成の触媒として応用することを目的とした。昨年度は本酵素遺伝子の周辺領域の一次構造解析を行うと同時に、組換え大腸菌における大量発現を検討した。今年度は、組換え体より本酵素を精製し、酵素法によるD-アミノ酸含有ペプチドの合成等、応用面での用途開発を検討した。まず、アルカリD-ペプチダーゼを発現した組換え体の培養条件を種々検討し、酵素活性を最大にするような条件を見い出した。さらに、高活性株から本酵素を単一に精製し、酵素化学的な諸性質を元株より精製したアルカリD-ペプチダーゼと比較検討した。次いで、精製酵素を用いてD-アミノ酸メチルエステルからのD-アミノ酸オリゴマーの合成条件を検討した。その結果、100mMのトリエチルアミン-塩酸(pH 11.5)の反応系で50mMの基質存在下、30℃、1時間反応を行ったところ、D-フェニルアラニンの2量体及び3量体の生成が最高となった。また、反応液中に添加した各種水溶性有機溶媒により2量体及び3量体の生成は著しく減少したが、一方でDMSOの添加により4量体の顕著な生成が認められた。