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細菌由来のポリヒドロキシ酪酸分解酵素に関する研究

细菌源聚羟基丁酸酯降解酶的研究

基本信息

批准号：
09760098
负责人：
米田英伸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

近年プラスチック廃棄物による環境汚染が問題となるに至り、自然環境下で分解するポリヒドロキシ酪酸(PHB)等の生分解性プラスチックの開発が進められている。生分解性プラスチックの開発において必要不可欠である分解性試験のための試薬として有用であるPHBデポリメラーゼの大量生産、本酵素産生微生物の自然界における分布の検討、産生微生物間における本酵素の酵素化学的な相違点の検討、及び本酵素の一次構造解析による分子進化論的な考察を目的として本酵素を産生する微生物を広く自然界よりスクリーニングした。富山県下の土壌及び活性汚泥からのスクリーニングにより得られたPHB分解菌Arthrobactersp W6株はPHBデポリメラーゼを菌体外に分泌する。培養上清中の酵素活性が最大となる条件で本菌を培養し、得られた培養上清よりPHBデポリメラーゼを均一に精製した。この精製した酵素の至適温度・pH、安定温度・pH、阻害剤、基質特異性、補酵素の要求性、及び速度論的解析等の各種酵素化学的諸性質を検討し、他の微生物由来のポリヒドロキシ酪酸加水分解酵素と比較した。本年度においては、新たに本菌からゲノミックDNAを抽出し、適当な制限酵素で断片化した後、プラスミドに挿入してゲノミックDNAライブラリーを作製した。これよりPHBデポリメラーゼをコードする遺伝子を含むクローンをPHBを含む不透明なプレート上に現れるクリアーゾーンを指標としてPHBデポリメラーゼ活性を有する形質転換大腸菌を選抜した。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、そこから推定される本酵素の一次構造を他の微生物由来のポリヒドロキシ酪酸加水分解酵素と比較した。さらに、得られたPHBデポリメラーゼ遺伝子を用いて大腸菌での大量発現系の構築を試みた。

In recent years, waste disposal has caused environmental pollution problems and has not decomposed in the natural environment. Biodegradable biodegradable chemicals such as ポリヒドロキシbutyric acid (PHB) and other raw materials. The decomposition test is necessary and the decomposition test is not useful. Mass production of あるPHB デポリメラーゼの, distribution and distribution of this enzyme-producing microorganism in nature Discussing the points of conflict in enzyme chemistry among microorganisms and analyzing the primary structure of this enzyme and molecule The purpose of the investigation of the theory of evolution is that the enzyme is produced and the microorganism is produced in nature. Toyama Prefecture's soil and activated sludge activated sludge Arthrobactersp The W6 strain is a PHB strain that secretes bacteria outside the body. The maximum enzyme activity in the culture supernatant is obtained by culturing the bacteria under the conditions of the culture supernatant, and the culture supernatant of the culture supernatant is obtained by homogeneous and refined PHB. Optimal temperature and pH of refined enzymes, stable temperature and pH, inhibitors, substrate specificity, enzyme supplementation requirements, and speed theory Analysis of various chemical properties of various enzymes, etc., and comparison of other microbial origins of butyric acid hydrolytic enzymes. This year's DNA extraction, new bacteria's DNA extraction, appropriate restriction enzymes After fragmentation, the プラスミドに was inserted into the してゲノミックDNA ライブラリーを production system.これよりPHB デポリメラーゼをコードする伝子を contain むクローンをPHB を contain むopaque なプレートThe current indicator of PHB index is the activity of PHB and the activity of coliform bacteria is selected. The original structure of the original enzyme and its origin of microorganisms are determined and compared with the butyric acid hydrolytic enzyme and comparison.さらに、Get the られたPHB デポリメラーゼ伝子を Use the いて coliform bacteria での発新発出款のconstruct みた.