腸管出血性大腸菌O157:H7の産生するベロトキシンに対する植物ワクチンの開発

针对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 产生的维罗毒素植物疫苗的开发

• 批准号: 13770134
• 负责人: 柳原 格
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health (2002)Osaka University (2001)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770134/
• 关键词: 腸管出血性大腸菌O157:H7; ベロトキシン; 経口ワクチン; ミヤコグサ; Agrobacterium tumefaciens; 腸管出血性大腸菌; 植物ワクチン

EHEC(O157:H7 Sakai株)の大腸上皮細胞定着に関与するintimin、TypeIII分泌系の構成因子であるEspA、EspB、ベロ毒素の標的細胞上のレセプターである糖脂質グロボトリオースセラミドに結合するBサブユニット(VT1-B)遺伝子をそれぞれクローニングし、植物形質転換に用いるためのバイナリーベクターを構築した。これらのベクターをType IV分泌機構を介して植物に感染することのできるAgrobacterium tumefaciensにエレクトロポーレーション法を用いて遺伝子導入した。次に、Lotus japonicus Miyakojima MG-20(ミヤコグサ)にA.tumefaciens LBA4404株を感染させ、抗原蛋白質をコードする遺伝子を導入した。このA.tumefaciensによる感染法ではミヤコグサの組織よりカルスを誘導、再分化させるという過程があり、形質転換植物の作成に約5ヶ月を要した。現在、上記4種類のEHEC(Sakai株)形質転換体第1世代を栽培中である。また、植物体における導入遺伝子発現の確認を行なうため、大腸菌BL21(DE3)を用いたEspA、EspB、intimin、VT1-Bサブユニットの大量発現系を構築した。発現システムはpETシステムを用い、His-taggedカラムにより粗精製を、その後ゲルろ過等を用いてより高純度のタンパク質を取得、抗体を作成している。現在までに、再生個体第0世代と同様に形質転換体第1世代植物におけるPCRにより遺伝子の挿入は確認済みである。導入した遺伝子を遺伝的に安定化させるためには、形質転換体の継代を繰り返し、安定した形質転換植物を得る。今後、形質転換植物よりタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットなどによる発現の確認の後、動物実験を用い抗原特異的抗体の産生などを検討し、今後の経口ワクチン開発に役立てたい。

EHEC(O157:H7 Sakai strain) is a cell of large intestine epithelial cells. It is related to the localization of EspA, EspB and Type III secreting system components. It is composed of glycolipid, lipid and B (VT1-B) genes. Type IV secretion mechanism mediates plant infection, and Agrobacterium tumefaciens is used for gene introduction. In addition, Lotus japonica Miyakojima MG-20() infected A.tumefaciens LBA4404 strain and introduced antigen protein into the genome. A.tumefaciens infection method is used to induce and redifferentiate plants. The process of plant formation and morphological transformation is about 5 months. The first generation of EHEC(Sakai strain) is under cultivation. Construction of a mass production system using Escherichia coli BL21 (DE3), EspA, EspB, Intimin, VT1-B, etc. The discovery system is composed of pET system, His-tagged system, crude purification system, post-purification system, etc. The first generation of plants was identified by PCR and the second generation of plants was identified by PCR. The introduction of the seed into the plant is a process of stabilization. In the future, after the identification of the occurrence of plant species, the production of antigen-specific antibodies in animals will be investigated, and the future development of plant species will be established.

项目成果

Fujiyama K: "Human N-actylglucosaminyltranferase I. Expression in E. coli as a soluble enzyme, and application as an immobilized enzyme for the chemoenzymatic synthesis of N-linked oligosaccharides"J.Bioeng.Biosci.. (in press).

Fujiyama K：“人 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 I。在大肠杆菌中作为可溶性酶表达，以及作为 N-连接寡糖化学酶促合成的固定化酶的应用”J.Bioeng.Biosci..（出版中）。

Cantarelli VV: "Talin, a host cell protein, interacts directly with the translocated intimin receptor, Tir, of enteropathogenic Escherichia coli, and is essential for pedestal formation"Cell Microbiol.. 3・11. 745-751 (2001)

Cantarelli VV：“Talin，一种宿主细胞蛋白，直接与致病性大肠杆菌的易位 intimin 受体 Tir 相互作用，对于基座形成至关重要”Cell Microbiol.. 3・11 (2001)。

Vlademir V.Cantarelli: "Cortactin is necessary for F-actin accumulation in pedestal structures induced by Enteropathogenic Escherichia coli infection"Infection and Immunity. 70・4. 2206-2209 (2002)

Vlademir V.Cantarelli：“Cortactin 对于肠致病性大肠杆菌感染诱导的基座结构中的 F-肌动蛋白积累是必需的”感染和免疫 70・4 (2002)。