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肝細胞三次元培養系から得られたC型肝炎ウイルス粒子の性状解析

从三维肝细胞培养系统获得的丙型肝炎病毒颗粒的表征

基本信息

批准号：
13770156
负责人：
相崎英樹
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

フラスコにて培養した1x10^9個のFLC4細胞を培地制御槽に播種し、1日当たり無血清または2%血清添加培地50-100mlを用い、温度を37度より徐々に低下させ培養したところ、肝細胞を100日以上の長期に渡り、継代することなしに培養することができ、その間、酸素消費量、グルコース消費量などで示される肝細胞の活動性は保たれていた。この3次元培養系に感染性クローンRNA 10ugをトランスフェクションしたところ、培養上清中のHCVRNAはトランスフェクション後から徐々に減少し、44,47,51,54日目には10^3copies/ml未満が続いたものの、その後57日目に再び10^4copies/mlまで増加し、100日目まで約10^<3-4>copies/mlと持続した。また、培養上清中のコア蛋白も徐々に増加した。この培養液中のウイルス粒子の存在様式を調べるために、トランスフェクション後100日目前後の培養液を超遠心法で濃縮し、電子顕微鏡で観察したところ、様々なサイズのウイルス様粒子が認められた。この濃縮培養上清について抗HCVE1抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行したところ、特異的に反応する50-60nmのウイルス様粒子を認めた。そこで濃縮培養上清をショ糖密度勾配法にて分画したところ、コア蛋白の多い分画の密度は約1.07および1.18g/mlで2峰性になり、HCV RNAの多い分画は約1.07g/mlであった。このことから培養液中に2種類のウイルス粒子の存在が示唆された。平成14年度はそれぞれの分画について抗core, E1,E2抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行し、より詳細な粒子の性状解析を行う予定である。

Culture of 1x10^9 FLC4 cells in culture tank for seeding, 1 day, serum-free, 2% serum, 50-100ml culture medium, temperature 37 ° C, low temperature, culture for more than 100 days, long-term culture for hepatocytes, acid consumption, The increase in the consumption of calories shows that the activity of liver cells is no longer maintained. After 10 μ g of infectious RNA was added to the culture medium, HCV RNA in culture supernatant decreased gradually from 10^3 copies/ml to 44, 47, 51 and 54 days, increased from 10^4 copies/ml to 10^4 copies/ml to 100 <3-4>days. The protein in the supernatant was increased. After 100 days, the culture solution was concentrated by ultra-long distance method and observed by electron microscope. This concentrated culture supernatant contains anti-HCVE1 antibodies, which are identified by indirect immunoelectrochemistry and specific anti-HCVE1 particles at 50-60nm. The concentration of HCV RNA in culture supernatant was about 1.07 g/ml and the concentration of HCV RNA was about 1.07 g/ml. The presence of two kinds of particles in the culture medium indicated that the two kinds of particles existed in the medium. In 2014, the classification of anti-core, E1,E2 antibodies was carried out by indirect immunoelectroanalysis method, and the characteristics of particles were analyzed in detail.