神経系培養細胞SH-SY5Yに発現するオピオイド受容体μ2サブタイプの本態の解明

阐明培养神经系统细胞 SH-SY5Y 中表达的阿片受体 μ2 亚型的真实性质

• 批准号: 14770768
• 负责人: 正田 丈裕
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770768/
• 关键词: μオピオイド受容体; SH-SY5Y; splice variant; oligomer; hetero-oligomer

異なる種類のG蛋白共役受容体がoligomerを形成してその特性を変化させることが報告されているが、1種類の受容体のsplice Variantが細胞に共発現して新たな特性を獲得する可能性については検討されていない。本研究では、μオピオイド受容体のsplice variant同志がoligomerを形成し、その薬理学的特性を変化させる可能性を検討することを目的とした。ヒトμオピオイド受容体の2つのsplice variant、MOR1とMOR1AのPCRプライマーを作製し、神経由来培養細胞SH-SY5Yから抽出したTotal RNAを鋳型としてRT-PCRを行なった。その結果、SH-SY5YにはMOR1とMOR1AのmRNAが存在する事を明らかにした。さらに、MOR1、MOR1AのcDNAをクローニングし、発現ベクターに組込み、それらを細胞に発現させると、それぞれμオピオイド受容体の特異的アゴニストDAMGOに高い親和性を有することを明らかにした。MOR1とMOR1Aを区別する抗体は手に入らないので、異なるエピトープタグ(HA-tagとFLAG-tag)をアミノ末端に結合させたconstructをPCRによって作製した。MOR1、MOR1Aが分子レベルで結合しているか(hetero-oligomerを形成しているか)を検討するため、培養細胞HEK293に共発現して、免疫沈降-イムノブロット分析を行った。その結果、両分子が結合している証拠は得られなかった。MOR1のsplice variant、MOR1B、1C、1Dは生体内でその分布を異にするという報告があり、splice variantどうしが同じ細胞に存在することは知られていない。今後は、MOR1とMOR1Aの生体内分布をin situ hybridizationあるいはimmunohistochemistry等で検討したい。

Different types of G-protein cooperating receptors がoligomerをformationしてそのcharacteristicsを変化させることがreportされているが、1 type of receptor のsplice Variant が cells に 発 appear し て new た な characteristics を obtain す る possibility に つ い て 検 ask さ れ て い な い. The purpose of this study is to formulate the splice variant of the μオピオイドacceptor and to form the oligomer, and to analyze the characteristics and possibility of transformation of the science.ヒトμオピオイド Acceptor の2 つのsplice variant, MOR1 とMOR1A のPCR プライマーを Production し, SH-SY5Y から extracted したTotal RNA type and RT-PCR type.そのRESULTS, SH-SY5YにはMOR1とMOR1AのmRNAがexistentする事を明らかにした.さらに、MOR1、MOR1AのcDNAをクローニングし、発行ベクターにgroup込み、それらをcell に発appearさせThe specific アゴニストDAMGO has a high affinity for the ると, それぞれμオピオイド receptor, and the することを明らかにした. MOR1 and MOR1A をdifferentiation するantibody は手に入らないので、isoなるエピトープタグ(HA-tagとFLAG-tag)をアミノENDに合させたconstructをPCRによって做出した. MOR1, MOR1A molecular hetero-oligomer combination (hetero-oligomer formation)るか)を検するため, cultured cells HEK293にKO発appearして, immunosedimentation-イムノブロット analysis を行った. The result of その, the combination of 両molecules and the proof got the result. MOR1 splice variant, MOR1B, 1C, 1D in vivo distribution report, splice The variant is the same as the cell. The existence of the variant is the same as the cell. From now on, we will discuss the in vivo distribution of MOR1 and MOR1A in situ hybridization and immunohistochemistry.