rhBMP-2誘導骨形成過程における内因性BMP-2の発現と骨誘導への関与

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rhBMP-2(5μg)とアテロペプチドI型コラーゲン溶液(6mg)を混合後,凍結乾燥を行い4 X 1.5mmのディスク状ペレットに圧縮成型し,6週齢雄性Wistar系ラット30匹の左側下腿部筋肉内に移植した陽性対照には6週齢雄性Wistar系ラットの頸骨を用いた.In situ hybridization用試料は軟X線撮影により石灰化度合を確認後,4%PFAで灌流固定しBMPペレットを摘出,10%EDTAで3曰間脱灰後パラフィン包埋した.8μm切片を作製し脱パラフィン後,proteinase K処理し4%PFAで後固定した.prehybridizationを30℃2時間行い,BMP-2 cDNAプロ-ブを用いたhybridizationを30℃12時間行った.洗浄後,アルカリフォスファターゼ標識抗FITC抗体で室温1時間,続いてBCIP/NBT発色基質で30℃1時間処理しメチルグリーンで核染後,pristiine mountで封入したBMP-2 mRNAのシグナルは一部の骨芽細胞,骨細胞に認められた.リアルタイムPCR用試料は軟X線撮影後,BMPペレットを摘出し液体窒素で凍結した.-80℃で保存後total RNAを抽出し,Omuniscript RT Kitを用いてcDNAを合成した.rat BMP-2のTaqMan probeとABI PRISM 7700を用いてリアルタイムPCRを行い,頸骨に対して異所性誘導骨は約20倍のBMP-2 mRNAが得られた.以上の結果より,内因性BMP-2がrhBMP-2誘導骨形成の進行に関与していることが示唆された.