rhBMP-2誘導骨形成過程における内因性BMP-2の発現と骨誘導への関与

rhBMP-2诱导的成骨过程中内源性BMP-2的表达及其参与骨诱导的作用

• 批准号: 14771129
• 负责人: 中川 俊幸
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771129/
• 关键词: BMP-2; Runx2; 異所性骨形成; In situ hybridization; リアルタイムPCR; Cbfal; RT-PCR

rhBMP-2(5μg)とアテロペプチドI型コラーゲン溶液(6mg)を混合後,凍結乾燥を行い4 X 1.5mmのディスク状ペレットに圧縮成型し,6週齢雄性Wistar系ラット30匹の左側下腿部筋肉内に移植した陽性対照には6週齢雄性Wistar系ラットの頸骨を用いた.In situ hybridization用試料は軟X線撮影により石灰化度合を確認後,4%PFAで灌流固定しBMPペレットを摘出,10%EDTAで3曰間脱灰後パラフィン包埋した.8μm切片を作製し脱パラフィン後,proteinase K処理し4%PFAで後固定した.prehybridizationを30℃2時間行い,BMP-2 cDNAプロ-ブを用いたhybridizationを30℃12時間行った.洗浄後,アルカリフォスファターゼ標識抗FITC抗体で室温1時間,続いてBCIP/NBT発色基質で30℃1時間処理しメチルグリーンで核染後,pristiine mountで封入したBMP-2 mRNAのシグナルは一部の骨芽細胞,骨細胞に認められた.リアルタイムPCR用試料は軟X線撮影後,BMPペレットを摘出し液体窒素で凍結した.-80℃で保存後total RNAを抽出し,Omuniscript RT Kitを用いてcDNAを合成した.rat BMP-2のTaqMan probeとABI PRISM 7700を用いてリアルタイムPCRを行い,頸骨に対して異所性誘導骨は約20倍のBMP-2 mRNAが得られた.以上の結果より,内因性BMP-2がrhBMP-2誘導骨形成の進行に関与していることが示唆された.

rhBMP-2(5μg) was mixed with Ateropidade Type I Curaogen solution (6mg), freeze-dried and compressed into a 4 X 1.5 mm descuk-shaped capsule. The positive control was transplanted into the left lower leg muscle of 30 male Wistar rats at 6 weeks old and used on the neck bone of 30 male Wistar rats at 6 weeks old. After confirming the degree of calcification of the sample for situ hybridization by soft X-ray photography, 4% PFA perfusion fixation, BMP extraction, 10% EDTA, 3 days deashing, embedding,.8μm slice preparation, deashing,proteinase K treatment, 4% PFA fixation, prehybridization, 30℃, 2 days,BMP-2 cDNA hybridization, 30℃, 12 days. After washing, BMP-2 mRNA was injected into some bone bud cells by pristiine mount, and bone cells were identified. After soft X-ray analysis of the sample for PCR,BMP was extracted and the liquid was frozen. Total RNA was extracted after preservation at 80℃, and Omuniscript RT Kit was used to synthesize BMP-2 mRNA using TaqMan probe and ABI PRISM 7700. These results suggest that endogenous BMP-2 and rhBMP-2 are involved in bone formation.