コンドロイチン硫酸の生合成に関与する新規硫酸基転移酵素の同定およびその機能解析

コンドロイチン硫酸(CS)/デルマタン硫酸(DS)は、その構成二糖単位の様々な位置で硫酸化修飾され、多様な構造を獲得している。近年の研究から、CS/DS中の特定の硫酸化構造が神経突起伸長や細胞接着などの生物機能発現に重要であることが明らかになってきた。従って、CS/DSの硫酸化修飾の生物学的意義を解明するために、CSの特徴的な硫酸化パターンを形作る硫酸基転移酵素の同定と厳密な基質特異性を明らかにすることは重要である。昨年度までに、CS/DSの主要な硫酸化構造であるGalNAc4位の硫酸化に関わる3種の硫酸基転移酵義(D4ST-1,C4ST-1,C4ST-2)の詳細な基質特異性を調べ、D4ST-1がDSに特徴的な4-Ο-硫酸化に必須で、C4ST-1がCSの4-Ο-硫酸化を触媒する主要な酵素であることを明らかにした。本年度は、これら遺伝子の発現と生物機能との相関を明らかにすることを目標に解析を行った。1)マウス脳におけるCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素郡の発現分布様々な生後発達段階のマウス脳より作成した凍結切片を用い、CS/DSの二糖組成分析とD4ST-1,C4ST-1およびC4ST-2を標的としたin situ hybridizationを行った。二糖組成解析から、小脳は脳の他の領域に比べ、DS鎖を多く含むことがわかった。興味深いことに、DSの生合成に必須なD4ST-1の発現も小脳に特異的に見られ。従って、DS鎖が小脳の神経回路網に深く関与していることが示唆された。2)Zebrafish胚におけるCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素の同定と機能解析Zebrafishは近年、脊椎動物の発生研究に有用なモデル動物として注目されている。従って、in vivoにおけるCS/DSのGalNAc4位の硫酸化の役割を明らかにするために、ZebrafishのCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素を網羅的にクローニングし、基質特異性を詳細に調べた。Zebrafishにおいてもそれぞれヒトのオーソロガス遺伝子と考えられる3種の酵素遺伝子(D4ST-1,C4ST-1およびC4ST-2)が存在した。現在、各遺伝子に特異的なモルフォリノオリゴヌクレオチドを作成し、各標的遺伝子の発現を欠損させ、それらの表現型を解析している。

コンドロイチン硫酸(CS)/デルマタン硫酸(DS)は、その構成二糖単位の様々な位置で硫酸化修飾され、多様な構造を獲得している。近年の研究から、CS/DS中の特定の硫酸化構造が神経突起伸長や細胞接着などの生物機能発現に重要であることが明らかになってきた。従って、CS/DSの硫酸化修飾の生物学的意義を解明するために、CSの特徴的な硫酸化パターンを形作る硫酸基転移酵素の同定と厳密な基質特異性を明らかにすることは重要である。昨年度までに、CS/DSの主要な硫酸化構造であるGalNAc4位の硫酸化に関わる3種の硫酸基転移酵義(D4ST-1,C4ST-1,C4ST-2)の詳細な基質特異性を調べ、D4ST-1がDSに特徴的な4-Ο-硫酸化に必須で、C4ST-1がCSの4-Ο-硫酸化を触媒する主要な酵素であることを明らかにした。本年度は、これら遺伝子の発現と生物機能との相関を明らかにすることを目標に解析を行った。1)マウス脳におけるCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素郡の発現分布様々な生後発達段階のマウス脳より作成した凍結切片を用い、CS/DSの二糖組成分析とD4ST-1,C4ST-1およびC4ST-2を標的としたin situ hybridizationを行った。二糖組成解析から、小脳は脳の他の領域に比べ、DS鎖を多く含むことがわかった。興味深いことに、DSの生合成に必須なD4ST-1の発現も小脳に特異的に見られ。従って、DS鎖が小脳の神経回路網に深く関与していることが示唆された。2)Zebrafish胚におけるCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素の同定と機能解析Zebrafishは近年、脊椎動物の発生研究に有用なモデル動物として注目されている。従って、in vivoにおけるCS/DSのGalNAc4位の硫酸化の役割を明らかにするために、ZebrafishのCS/DS 4-Ο-硫酸基転移酵素を網羅的にクローニングし、基質特異性を詳細に調べた。Zebrafishにおいてもそれぞれヒトのオーソロガス遺伝子と考えられる3種の酵素遺伝子(D4ST-1,C4ST-1およびC4ST-2)が存在した。現在、各遺伝子に特異的なモルフォリノオリゴヌクレオチドを作成し、各標的遺伝子の発現を欠損させ、それらの表現型を解析している。