好中球活性酸素発生系におけるp47phoxによる活性制御に関する構造生物学的研究

今年度は,好中球活性酸素発生系p47phoxの自己阻害状態における立体構造解析をおこなった.p47phoxのタンデムSH3ドメインおよび自己阻害領域を含むコンストラクト(残基番号151から340)の結晶化をおこない,最終的に,PEG6000を沈殿剤として長さ0.35mmの単結晶を得た.Spring-8放射光施設のBL41XUビームラインを用いて,この結晶のX線回折像を取得した.セレノメチオニン変異体を用いたMAD法により,回折像の位相を決定したのち,CNSプログラムにより,最終的に分解能3.5Åの立体構造を得た.得られた立体構造は,βストランドを一部お互いに交換する形で,ダイマーを形成していた.生体内中では,p47phoxはモノマーとして挙動することが示されているので,この結晶構造は,結晶化の過程で生じたものと考えられる.このダイマーをそれぞれ単一のモジュールとして置換したものが生体内での立体構造を反映するものと推定した.この立体構造では,自己阻害領域のうちGAPPRと呼ばれる配列が,ポリプロリンII型ヘリックスを形成して,ふたつのSH3ドメインのp22結合部位と相互作用していた.さらに,自己阻害領域の多くの部分が,ふたつのSH3ドメインと強い相互作用を有していた.p47phoxは,自己阻害領域のセリンがリン酸化修飾を受けることで,自己阻害状態から活性化状態に移行することが知られているが,リン酸化修飾を受けると予想されているセリンは,SH3ドメインとのあいだの相互作用部位に位置していた.

今年度は,好中球活性酸素発生系p47phoxの自己阻害状態における立体構造解析をおこなった.p47phoxのタンデムSH3ドメインおよび自己阻害領域を含むコンストラクト(残基番号151から340)の結晶化をおこない,最終的に,PEG6000を沈殿剤として長さ0.35mmの単結晶を得た.Spring-8放射光施設のBL41XUビームラインを用いて,この結晶のX線回折像を取得した.セレノメチオニン変異体を用いたMAD法により,回折像の位相を決定したのち,CNSプログラムにより,最終的に分解能3.5Åの立体構造を得た.得られた立体構造は,βストランドを一部お互いに交換する形で,ダイマーを形成していた.生体内中では,p47phoxはモノマーとして挙動することが示されているので,この結晶構造は,結晶化の過程で生じたものと考えられる.このダイマーをそれぞれ単一のモジュールとして置換したものが生体内での立体構造を反映するものと推定した.この立体構造では,自己阻害領域のうちGAPPRと呼ばれる配列が,ポリプロリンII型ヘリックスを形成して,ふたつのSH3ドメインのp22結合部位と相互作用していた.さらに,自己阻害領域の多くの部分が,ふたつのSH3ドメインと強い相互作用を有していた.p47phoxは,自己阻害領域のセリンがリン酸化修飾を受けることで,自己阻害状態から活性化状態に移行することが知られているが,リン酸化修飾を受けると予想されているセリンは,SH3ドメインとのあいだの相互作用部位に位置していた.