海綿由来の細胞毒性物質onnamide Aの作用機序に関する研究

海绵细胞毒性物质onnamide A的作用机制研究

• 批准号: 14780468
• 负责人: 濱田 季之
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780468/
• 关键词: 海綿; 細胞毒性物質; 作用機序; 標的タンパク質; アフィニティークロマトグラフィ; 光親和性標識; リボソーム; 細胞毒性; 活性発現メカニズム; アフィニティーカラ; MALDI-TOF MS; 一次構造データベース; HeLa細胞

海綿Theonella swinhoeiから単離された細胞毒性物質onnamide Aの作用機序を明らかにするため、その標的タンパク質を探索した。まず、onnamide Aアフィニティークロマトグラフィーを用いた標的タンパク質の網羅的探索として、onnamide Aの直鎖状構造部分のカルボン酸を介してaminoalkyl agarose gelとstreptavidin gelにそれぞれ結合させた。タンパク質源としてHeLa細胞の細胞質画分を用い、標的タンパク質を精製したところ、SDS-PAGE上で十数種の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。それらのバンドは、アミノ酸N末シークェンス法やpeptide mass finger printing法により同定した。次に、光親和性標識化合物(アフィライト-CHO)とonnamide Aを化学結合させ、それをプローブとして標的タンパク質を探索した。光親和性標識onnamide AをHeLa細胞の細胞質画分と80Sリボソーム画分のそれぞれと混合し、SDS電気泳動、続くウェスタンブロッテイング後にAP標識ストレプトアビジンを用いた化学発光により、細胞質画分では1種(50kDa)、80Sリボソーム画分からは数種(50kDa,35-40kDa,15kDa)の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。これらのバンドについては、peptide mass finger printing法などを用いて同定を行なう予定である。これまでの研究及び知見から、onnamide Aは、pederin同様、リボソームと相互作用していることが分かった。今後は、リボソーム画分からの標的タンパク質の探索、同定を進め、onnamide Aの作用機序について考察する予定である。

Sponge Theonella swinhoei is a cytotoxic substance. The mechanism of action of onamide A is to be explored. The structure of onamide A in the form of a chain of amino alkyl agarose gel streptavidin gel was studied. The cytoplasm of HeLa cells was extracted from the cytoplasm of HeLa cells by SDS-PAGE, and the cytoplasm of HeLa cells was purified by SDS-PAGE The method of peptide mass finger printing is the same as the method of peptide mass finger printing Second, the photoaffinity identification compound (CHO) and onamide A are chemically bound to each other, and their properties are explored. The photoaffinity marker onnamide A was used in the cytosol of HeLa cells. The 80S fluorescent protein was mixed with SDS electrophoresis, and the 80S fluorescent protein was used in the cytosol of HeLa cells. One (50kDa) and several (50kDa,35-40kDa,15kDa) fluorescent protein was detected. The method of peptide mass finger printing is used in the same way. The study and understanding of this phenomenon, onnamide A, pederin identity, and the interaction between them, In the future, we will explore the quality of onamide A, and investigate the action mechanism of onamide A.