海綿由来の細胞毒性物質onnamide Aの作用機序に関する研究

海绵细胞毒性物质onnamide A的作用机制研究

基本信息

批准号：
14780468
负责人：
濱田季之
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780468/
关键词：
海綿細胞毒性物質作用機序標的タンパク質アフィニティークロマトグラフィ光親和性標識リボソーム細胞毒性活性発現メカニズムアフィニティーカラ MALDI-TOF MS 一次構造データベース HeLa細胞

项目摘要

海綿Theonella swinhoeiから単離された細胞毒性物質onnamide Aの作用機序を明らかにするため、その標的タンパク質を探索した。まず、onnamide Aアフィニティークロマトグラフィーを用いた標的タンパク質の網羅的探索として、onnamide Aの直鎖状構造部分のカルボン酸を介してaminoalkyl agarose gelとstreptavidin gelにそれぞれ結合させた。タンパク質源としてHeLa細胞の細胞質画分を用い、標的タンパク質を精製したところ、SDS-PAGE上で十数種の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。それらのバンドは、アミノ酸N末シークェンス法やpeptide mass finger printing法により同定した。次に、光親和性標識化合物(アフィライト-CHO)とonnamide Aを化学結合させ、それをプローブとして標的タンパク質を探索した。光親和性標識onnamide AをHeLa細胞の細胞質画分と80Sリボソーム画分のそれぞれと混合し、SDS電気泳動、続くウェスタンブロッテイング後にAP標識ストレプトアビジンを用いた化学発光により、細胞質画分では1種(50kDa)、80Sリボソーム画分からは数種(50kDa,35-40kDa,15kDa)の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。これらのバンドについては、peptide mass finger printing法などを用いて同定を行なう予定である。これまでの研究及び知見から、onnamide Aは、pederin同様、リボソームと相互作用していることが分かった。今後は、リボソーム画分からの標的タンパク質の探索、同定を進め、onnamide Aの作用機序について考察する予定である。

为了阐明洋域A的作用机理，从海绵swinhoei分离出的细胞毒性物质，搜索了其靶蛋白。首先，作为使用Annamide A亲和力色谱法对靶蛋白进行详尽的搜索，靶蛋白分别通过羧酸的氨基烷基琼脂糖凝胶和链霉亲蛋白凝胶结合，分别在运动型A的线性结构部分中结合使用。当使用HeLa细胞的细胞质分数作为蛋白质源纯化靶蛋白时，在SDS-PAGE上检测到与十几个靶蛋白相对应的条带。通过氨基酸N末端测序和薄荷底质量指纹方法来鉴定这些条带。接下来，在化学上与标记化合物（Aphilite-cho）的光性结合，并将其用作探针来搜索靶蛋白。将光性标记的运动员与细胞质分数和80s的Hela细胞的核糖体分数混合在一起，带对应于一个物种的靶蛋白（50 kDa）在细胞质分数和几种物种中的靶蛋白（50 kDa），并使用SPESSS进行了35-40 kDa，由SPESS进行了APELTISTIS（50 kDa，35-40 kDa，theclum intermity）。链霉亲和素。这些频段将使用Pepperide质量指印方法等。先前的研究和发现表明，洋域A与Pederin这样的核糖体相互作用。将来，我们将继续从核糖体部分中搜索和识别靶蛋白，并考虑大对A的作用机理。