糖ヌクレオチド代謝異常が引き起こす細胞の悪性化機構の解析

糖核苷酸代谢异常引起的细胞恶变机制分析

• 批准号: 14760056
• 负责人: 藤田 憲一
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Osaka City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760056/
• 关键词: マウス繊維芽細胞; UDP-sugar hydrolase; 糖ヌクレオチド分解酵素; 細胞間接着; balb; c 3T3

マウス繊維芽細胞balb/c 3T3(3T3)株は接着系の培養細胞で、コンフルエントまで増殖すると、増殖を停止する。一方、本細胞株をSV40ウィルスで形質転換した3T3SV株はマウスの皮膚へ移植すると腫瘍を形成する悪性細胞である。本3T3SV株は細胞間の接着が弱く、コンフルエントに達しても増殖を続ける。加えて、3T3SV株の膜画分においては他細胞の認識に深く関わっている細胞表層の糖鎖の前駆体である糖ヌクレオチドを分解するUDP-sugar hydrolase(USH)が異常亢進している。本研究ではUSHの異常亢進が細胞表層の糖鎖および細胞の増殖に与える影響を明らかにしようとしている。まず、USHの異常亢進が3T3株の増殖に与える影響について調べた。大腸菌K-12株より抽出したゲノムDNAよりPCR法によりUSHのORFを増幅し、ドキシサイクリン(DOX)制御下でUSH発現調節可能なプラスミドを作製した。次いで、これにより形質導入を行い、3ヶ月間培養を続け、安定化したクローンを得た後、薬剤耐性を指標として本発現系を有する株を約200株選択した。コンフルエントまで増殖したこれらの株をDOXで処理したところ、膜画分にUSHの異常亢進が見られる株が数株取得できた。さらに、USHの異常亢進が認められた株についてその増殖特性を調べた。DOXの有無で3日間培養したところ、意外なことに、それら株の増殖はDOXの添加によりやや抑えられていることがわかった。また、それら株の細胞表面の糖鎖をマンノースおよびグルコースを認識するレクチン、コンカナバリンA(Con A)によって標識したところ、DOXの有無によるCon Aとの結合に有意の差は認められなかった。DOXの添加による増殖阻害は細胞表面の糖鎖構造に依存するものではなく、USHの異常亢進による糖ヌクレオチドプールの消失に依存するものかもしれない。

小鼠成纤维细胞BALB/C 3T3（3T3）菌株是粘附的培养细胞，并且在汇合生长时，停止了其增殖。另一方面，已用SV40病毒转化的3T3SV菌株是一种恶性细胞，当移植到小鼠皮肤中时形成肿瘤。该3T3SV菌株具有弱细胞 - 细胞粘附力，即使在汇合后仍继续增殖。此外，在3T3SV菌株的膜部分中，UDP-糖水解酶（USH）降解糖核苷酸，这些核苷酸是细胞表面层中聚糖的前体，它们与其他细胞的识别深深涉及，它们异常升高。这项研究试图阐明USH异常升高对细胞表面和细胞增殖的聚糖的影响。首先，我们研究了USH异常增加对3T3菌株生长的影响。从PCR从大肠杆菌K-12提取的基因组DNA中扩增了USH ORF，以产生一种可以调节强力霉素（DOX）下的USH表达的质粒。接下来，将细胞转导并培养3个月，并在获得稳定的克隆后，使用耐药性作为指标选择了大约200个本表达系统。当用DOX处理这些成长为汇合的菌株时，几种菌株能够在膜分数中获得异常增加的USH。此外，研究了USH异常增加的菌株的生长特征。当有或没有DOX的情况下培养3天时，发现这些菌株的生长被添加的DOX稍微抑制了。此外，当将这些菌株细胞表面的甘甘用凝集素标记为识别甘露糖和葡萄糖的凝集素，凝集素，connavalin a（con a），并且与或没有dox的con a的结合无显着差异。通过添加DOX的生长抑制不取决于细胞表面聚糖结构，而是由于USH异常增加而取决于糖核苷酸池的消失。