リアルタイム菌体pH測定法の開発とSha輸送系によるpH環境調節機構の解明

实时细菌细胞pH测量方法的开发及Sha转运系统pH环境调节机制的阐明

基本信息

批准号：
14760066
负责人：
古園さおり
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760066/
关键词：
GFP pHプローブ菌体内pH pH恒常性枯草菌大腸菌 pH応答性動的変化

项目摘要

本研究は、pH感受性GFP変異体をpHプローブとして用いて、動的変化や局所的変化を含めた菌体内pHに関する詳細な情報を得ることを目的としている。本年度は、Bacillus属細菌におけるpH測定系の確立と、大腸菌の膜近傍pHの測定を行った。枯草菌や好アルカリ性菌などのBacillus属細菌における本pHプローブの発現量は大腸菌に比べて低く、そのままでは精度の良い測定が困難であるため、プロモーター改変等による発現量の上昇を試みた。枯草菌において構成的に高発現するS10プロモーターと統計学的に最適と予想されるリボソーム結合部位をpHプローブ遺伝子の上流に付加し、多コピーベクターpGETS103上で発現させた。その結果、Pspacプロモーターを用いた従来の場合と比べて数倍の蛍光強度の上昇が認められた。今後この系を用いて、大腸菌と枯草菌のpH恒常性を比較検討することが可能である。膜近傍pHの測定を目的として、大腸菌由来の様々な膜蛋白質とpHプローブとの融合蛋白質の発現を試みた。二次構造予測プログラムから膜貫通領域と予想される部分を抽出し、PHプローブのN末端側に融合・発現させた。その結果、浸透圧センサー蛋白質EnvZのN末側領域240アミノ酸残基を付加した場合に有意な蛍光強度が観察された。またpHプローブが膜画分に局在することを、ウェスタン解析により確認した。この系を用いて大腸菌の細胞質と膜近傍のpH恒常性を比較したところ、膜近傍pHは細胞質pHよりもややアルカリである傾向が認められた。本研究により、従来の方法では不可能であった菌体内pHの動的変化や局所的変化を調べることが可能になった。今後は、高い菌体濃度による蛍光の内部遮蔽効果など細菌特有の問題を解決しつつ、より良い系を確立していくことが課題である。

这项研究旨在使用pH敏感的GFP突变体作为pH探针获得有关细胞内pH的详细信息，包括动态和局部变化。今年，我们建立了一个杆菌属细菌的pH测量系统，并测量了大肠杆菌的近膜pH。该pH探针在芽孢杆菌细菌（如枯草芽孢杆菌和碱性细菌）中的表达水平低于大肠杆菌的表达水平，并且很难按原样准确地测量，因此我们试图通过修饰启动子来提高表达水平。 pH探针基因的，并在多拷贝矢量PGETS103上表达。结果，与使用PSPAC启动子相比，荧光强度增加了几倍。该系统将来可以用于比较和检查大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的pH稳态。为了测量近膜pH，我们试图在衍生自大肠杆菌和pH探针的各种膜蛋白之间表达融合蛋白。从二级结构预测程序中提取了预期的跨膜区域和部分，并在pH探针的N末端融合并表达所得的混合物。结果，当加入渗透压传感器蛋白ENVZ的N末端区域上的240个氨基酸残基时，观察到明显的荧光强度。此外，西方分析证实了pH探针定位于膜分数。使用该系统，比较了大肠杆菌中细胞质和膜附近的pH稳态，并发现膜的附近比细胞质pH值稍微碱化略高。这项研究使得通过常规方法不可能研究细胞中pH的动态和局部变化。将来面临的挑战是建立一个更好的系统，同时解决细菌独有的问题，例如高细胞浓度的内部屏蔽效应。