Development of functional fluorescent probe for imaging osteocyte function and 4D nucleomics

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本研究では、細胞内分子機能解明に加え生物個体における細胞機能を観察できる化学ツールの設計法を確立する。これまでの蛍光プローブ開発の発展型として化学分子設計と蛋白質科学技術と融合することで、in vivo解析へ応用可能な化学プローブへと深化させる。最終的にこれらのプローブを細胞から動物個体へ応用し、生物学における問題解決を目指す。本年度では(i)骨細胞機能を明らかにする二光子励起in vivoイメージングプローブの開発、および(ii)蛋白質の機能性分子ラベル化技術の開発によるオルガネラ成熟時の局所pH計測プローブの開発を進めた。(i)においては、従来の蛍光強度増強型のプローブでは達成できなかった骨組織におけるpHの定量評価系の確立のため、pHの低下により蛍光波長がシフトするレシオ型蛍光プローブの開発に取り組んだ。pHによって吸収が変化する色素をアクセプター色素としたFRET型のプローブを設計、合成した。ドナー側の色素を検討したところ、クマリン誘導体が破骨細胞が形成する低pH領域に応答してアクセプター側の色素とFRETを起こし、蛍光波長が変化することを確認した。(ii)においては、細胞外から物質を取り込むエンドサイトーシスにおいてエンドソームからリソソームへの成熟過程でpHが低下する様子を観察するため、タンパク質にタグを介してpH応答性のプローブをラベル化する手法の開発を行った。われわれの研究室で独自に開発したPYPタグによるラベル化法を用いるため、PYPのリガンドにpH応答性蛍光色素を導入したプローブを設計・合成した。本プローブはラベル化時に蛍光強度が上昇するだけでなく、pHに応答して蛍光波長がシフトすることが観察された。また、PYPタグのリガンドについて検討したところ、効率よくラベル化が起こる新たなリガンド構造を見出した。