酢酸菌PQQ酵素の指向性進化と「ゆるい」基質特異性の理解

了解醋杆菌 PQQ 酶的定向进化和“松散”底物特异性

• 批准号: 22K05383
• 负责人: 阿野 嘉孝
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05383/
• 关键词: PQQ酵素; 酢酸菌; 酵素; グリセロール脱水素酵素

酢酸菌においてピロロキノリンキノン（PQQ)を補欠分子族とするPQQ酵素は、産業的な物質生産の中心的役割を担う重要な酵素群であり「ゆるい」基質特異性を示すことが特徴的である。このゆるい基質特異性に起因して新しく発見される酵素反応は、持続可能社会のための新たな微生物変換技術の創出にもつながることから注目されている。本研究では、このゆるい基質特異性の構造学的理解を深めるために、その障害となっていた酵素安定性の向上、さらには物質生産性の向上を目指して、進化指向的変異導入法を確立して優良変異体を獲得することを目的とし、得られた変異体酵素を用いて基礎研究および応用研究を深めることにある。１年目となる今年度は、酢酸菌PQQ依存性グリセロール脱水素酵素（GLDH）の変異体取得に注力した。申請者の考案した「酢酸菌直接形質転換選抜法」を実施して各工程の最適化を図り、得られた変異体の性能価を進めた。また、ゲノムシャッフリングによる多重変異導入法の条件も確立し、GLDHの「指向性変異法」の確立に向けて大きな進展を得た。変異酵素の性能評価を実施した結果、獲得した変異体は負の影響をもたらすものが多く、期待する機能が向上した変異体取得に向けて継続した変異導入が必要であると判断した。その中で、２株の酵素活性の安定化に繋がる変異体の取得に成功し、変異体酵素の性能を評価するとともに、発酵生産性への影響を調査しているところである。２年目以降は、これまでの継続した変異体取得に加えて、獲得した２株の優良変異体の性能評価、さらには多重変異の導入によりGLDHの指向性変異を進め、ゆるい基質得意性に関する知見を深めていく予定である。

具有吡咯喹啉亚酮（PQQ）作为乙酸细菌的假体群的PQQ酶是重要的酶群，它们在工业材料生产中起着核心作用，其特征是其“松散”底物特异性。由于这种松散的底物特异性，新发现的酶反应引起了人们的关注，因为它们还导致为可持续社会创造了新的微生物转化技术。为了加深我们对这种松散底物特异性的结构性理解，建立面向进化的诱变方法以获取出色的突变体的目的，以改善酶稳定性并进一步提高其促进其生产率（已阻碍它），以加深基本研究和应用的研究突变体辅酶。今年，第一年，我们专注于获得乙酸PQQ依赖性甘油脱氢酶（GLDH）的突变体。进行了申请人设计的“乙酸直接转化选择方法”以优化每个步骤，并且获得了所获得的突变体的性能评估。此外，已经建立了通过基因组改组引入多重诱变的方法的条件，并且在建立GLDH的“定向诱变”方面已取得了巨大进步。由于对突变酶的性能评估，确定许多获得的突变体具有负面影响，并且为了获得具有改善功能的突变体是必要的。其中，我们成功地获得了一种突变体，该突变体导致两种菌株的酶活性稳定，目前正在评估突变酶的性能，并正在研究对发酵生产率的影响。从第二年开始，除了到目前为止继续获取突变体外，我们计划评估获得的两个优秀突变体的性能，以及引入多个突变以推进GLDH中的方向突变，从而加深我们对松散底物专业知识的了解。

项目成果

Periplasmic dehydroshikimate dehydratase combined with quinate oxidation in Gluconobacter oxydans for protocatechuate production

氧化葡糖杆菌中周质脱氢莽草酸脱水酶与奎宁酸氧化相结合用于原儿茶酸生产

• DOI: 10.1093/bbb/zbac090
• 发表时间: 2022
• 期刊: Biosci Biotechnol Biochem.
• 作者: Nagaki K;Kataoka N;Theeragool G;Matsutani M;Ano Y;Matsushita K;Yakushi T.
• 通讯作者: Yakushi T.

Development of efficient 5-ketogluconate production system by Gluconobacter japonicus

日本葡萄糖酸杆菌高效生产5-酮葡萄糖酸系统的开发

• DOI: 10.1007/s00253-022-12242-0
• 发表时间: 2022
• 期刊: Appl Microbiol Biotechnol.
• 作者: Kataoka N;Naoki K;Ano Y;Matsushita K;Yakushi T.
• 通讯作者: Yakushi T.

Histamine elimination by a coupling reaction of fungal amine oxidase and bacterial aldehyde oxidase

通过真菌胺氧化酶和细菌醛氧化酶的偶联反应消除组胺

• DOI: 10.1093/bbb/zbac121
• 发表时间: 2022
• 期刊: Bioscience. Biotechnology. Biochem
• 作者: Masakatsu Usui;Hikari Kubota;Mizuki Ishihara;Haruka Matsuki;Shinya Kawabe;Yoshimasa Sugiura;Naoya Kataoka,Kazunobu Matsushita;Yoshitaka Ano;Yoshihiko Akakabe;Roque A. Hours;Toshiharu Yakushi; Osao Adachi
• 通讯作者: Osao Adachi