哺乳類におけるRNAiの確立とRNAiを用いた受精機能の解析

哺乳动物 RNAi 的建立以及利用 RNAi 分析受精功能

• 批准号: 14780625
• 负责人: 蓮輪 英毅
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780625/
• 关键词: RNAi; siRNA; トランスジェニックマウス; EGFP; polIII; RNAポリメラーゼIIIプロモーター

哺乳類において、長いdsRNAを用いたRNAiは毒性があることや効果の持続性がないことなどから、毒性のないsiRNAを用いRNAiを持続的に作用させる実験系を立ち上げた。RNAポリメラーゼIIIプロモーターでsiRNAを発現することができるベクターシステムを構築し、先ずはRNAiの効果をin vitroで検討した。EGFPを標的としたRNAiベクターを作製し、EGFPが安定に発現したES細胞に導入してみたところ、十分なRNAi効果が観察され、EGFPの発現が抑制された。さらなる応用として、RNAiベクターを用いトランスジェニックマウスを作製し、"green mouse"におけるEGFPの発現を抑制させることに成功している。この遺伝子発現抑制効果は、初期胚、新生仔、成熟したマウスにおいて、ほぼすべての組織で観察された。しかしながら、このRNAi法はまだ完成されたとはいえず、一部のRNAiトランスジェニックマウスにおいてRNAi効果がマウスの成長と共に無くなったり、標的とする遺伝子のどの配列でRNAiを行なうか、というように克服しなければならない点もある。これらの点を克服するために、安定して遺伝子発現が抑制できる新しいベクターの開発が必要だと考えており、その第一歩として、新しいプロモーターの探索を行ない、すでにリボザイムの発現系で用いられたtRNAの内部プロモーターを用いることで、RNAi法の効率化が図れることを見いだした。また、ベクターに導入する配列を一部改変することで、ベクターを安定化することに成功した。このベクターを用い、卵子で発現している遺伝子に関してRNAiを行ない解析中である。

Mammals に お い て, long い dsRNA を with い た RNAi は toxicity が あ る こ と や unseen fruit の hold 続 sex が な い こ と な ど か ら, toxic の な い siRNA を with い RNAi を hold 続 に role さ せ る be fasten 験 を stand on ち げ た. RNA ポ リ メ ラ ー ゼ III プ ロ モ ー タ ー で siRNA を 発 now す る こ と が で き る ベ ク タ ー シ ス テ ム を build し, first ず は RNAi の unseen fruit を in vitro で beg し 検 た. EGFP を mark と し た RNAi ベ ク タ ー を as し, EGFP が settle に 発 now し た ES cells に import し て み た と こ ろ, very な RNAi unseen fruit が 観 examine さ れ, EGFP の 発 now が inhibit さ れ た. さ ら な る 応 with と し て, RNAi ベ ク タ ー を with い ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を as し, "green mouse" に お け る EGFP の 発 now を inhibit さ せ る こ と に successful し て い る. The inhibitory effect of <s:1> cultural heritage 伝 offspring is た, initial embryo, newborn, mature seed た ウスにお て て, ほぼすべて で観 tissue で観 observation された. し か し な が ら, こ の RNAi method は ま だ complete さ れ た と は い え ず, a の RNAi ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に お い て RNAi unseen fruit が マ ウ ス の growth と total に none く な っ た り, mark と す る posthumous son 伝 の ど の match column で RNAi を line な う か, と い う よ う に overcome し な け れ ば な ら な い point も あ る. こ れ ら の を overcome す る た め に, stable し て posthumous son 伝 発 now が inhibit で き る new し い ベ ク タ ー の open 発 が necessary だ と exam え て お り, そ の first step と し て, new し い プ ロ モ ー タ ー の exploration line を な い, す で に リ ボ ザ イ ム の 発 department で now use い ら れ た tRNA の internal プ ロ モ ー タ ー を with い る こ と で, RNAi method The efficiency of が figure れる だ とを とを see だ だ た. ま た, ベ ク タ ー に import す る match column を a change - す る こ と で, ベ ク タ ー を stabilization す る こ と に successful し た. こ の ベ ク タ ー を い, egg で 発 now し て い る posthumous son 伝 に masato し て RNAi を line な い parsing で あ る.

项目成果

蓮輪英毅, 岡部勝: "RNAiノックダウンマウスの作製"メディカルサイエンスダイジェスト. 29・11. 440-443 (2003)

Hideki Hasuwa，Masaru Okabe：“RNAi 敲除小鼠的创建”《医学科学文摘》29・11（2003 年）。

Hasuwa H, Kaseda K, Einarsdottir T, Okabe M.: "Small interfering RNA and gene silencing in transgenic mice and rats"FEBS Letters. 532・1-2. 227-230 (2002)

Hasuwa H、Kaseda K、Einarsdottir T、Okabe M.：“转基因小鼠和大鼠中的小干扰 RNA 和基因沉默”FEBS Letters 532·1-2（2002）。

蓮輪英毅, 岡部勝: "RNAiを用いた個体レベルの遺伝子ノックダウン"医学のあゆみ. 208・8. 664-668 (2004)

Hideki Hasuwa、Masaru Okabe：“利用 RNAi 进行个体水平的基因敲除”医学史 208・8（2004 年）。