哺乳類におけるRNAiの確立とRNAiを用いた受精機能の解析

哺乳類において、長いdsRNAを用いたRNAiは毒性があることや効果の持続性がないことなどから、毒性のないsiRNAを用いRNAiを持続的に作用させる実験系を立ち上げた。RNAポリメラーゼIIIプロモーターでsiRNAを発現することができるベクターシステムを構築し、先ずはRNAiの効果をin vitroで検討した。EGFPを標的としたRNAiベクターを作製し、EGFPが安定に発現したES細胞に導入してみたところ、十分なRNAi効果が観察され、EGFPの発現が抑制された。さらなる応用として、RNAiベクターを用いトランスジェニックマウスを作製し、"green mouse"におけるEGFPの発現を抑制させることに成功している。この遺伝子発現抑制効果は、初期胚、新生仔、成熟したマウスにおいて、ほぼすべての組織で観察された。しかしながら、このRNAi法はまだ完成されたとはいえず、一部のRNAiトランスジェニックマウスにおいてRNAi効果がマウスの成長と共に無くなったり、標的とする遺伝子のどの配列でRNAiを行なうか、というように克服しなければならない点もある。これらの点を克服するために、安定して遺伝子発現が抑制できる新しいベクターの開発が必要だと考えており、その第一歩として、新しいプロモーターの探索を行ない、すでにリボザイムの発現系で用いられたtRNAの内部プロモーターを用いることで、RNAi法の効率化が図れることを見いだした。また、ベクターに導入する配列を一部改変することで、ベクターを安定化することに成功した。このベクターを用い、卵子で発現している遺伝子に関してRNAiを行ない解析中である。

哺乳類において、長いdsRNAを用いたRNAiは毒性があることや効果の持続性がないことなどから、毒性のないsiRNAを用いRNAiを持続的に作用させる実験系を立ち上げた。RNAポリメラーゼIIIプロモーターでsiRNAを発現することができるベクターシステムを構築し、先ずはRNAiの効果をin vitroで検討した。EGFPを標的としたRNAiベクターを作製し、EGFPが安定に発現したES細胞に導入してみたところ、十分なRNAi効果が観察され、EGFPの発現が抑制された。さらなる応用として、RNAiベクターを用いトランスジェニックマウスを作製し、"green mouse"におけるEGFPの発現を抑制させることに成功している。この遺伝子発現抑制効果は、初期胚、新生仔、成熟したマウスにおいて、ほぼすべての組織で観察された。しかしながら、このRNAi法はまだ完成されたとはいえず、一部のRNAiトランスジェニックマウスにおいてRNAi効果がマウスの成長と共に無くなったり、標的とする遺伝子のどの配列でRNAiを行なうか、というように克服しなければならない点もある。これらの点を克服するために、安定して遺伝子発現が抑制できる新しいベクターの開発が必要だと考えており、その第一歩として、新しいプロモーターの探索を行ない、すでにリボザイムの発現系で用いられたtRNAの内部プロモーターを用いることで、RNAi法の効率化が図れることを見いだした。また、ベクターに導入する配列を一部改変することで、ベクターを安定化することに成功した。このベクターを用い、卵子で発現している遺伝子に関してRNAiを行ない解析中である。