コオロギ色素拡散ホルモン様ペプチドの日周期的発現の分子生物学的解析

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色素拡散ホルモン様ペプチド(PDF)は昆虫の脳内に広く分布する神経ペプチドであり、概日時計機構に関与することが示唆されている。本研究では、PDFの時計機構への関与を明らかにする第一歩として、1)PDF蛋白質とmRNAの発現の日周リズム、2)PDFの核移行のタイミング、3)PDF発現と核移行のタイミングへの5'-UTRと3'-UTRの関与、の3点を明らかにすることを目的としている。本年度は、1)PDF発現の日周性の検討、および2)pdf mRNA発現の日周性の検討を計画した。まず、単一視葉内でのPDF発現の日周リズムを検討するため、PDFを定量する競合的ELISA法を確立した。脳視葉内からのPDFの抽出については、アセトン、酢酸、エタノール等での抽出を試みた結果、4%酢酸での抽出が最も適していることがわかった。そこで、この手法により、明暗周期下で各時間ごとに視葉から抽出したサンプルを用いて、視葉内PDFの日周変動を解析したところ、明期に少なく暗期に増加する周期的な発現が見られた。明期の中ほどで単一視葉内のPDFは約200fmolであり、暗期の中ほどでピークを示しそのときの含有量は約680fmolであった。したがって,昼夜変動は約3.4倍と見積もられた。現在、恒暗条件下でサンプルを行い、PDF量の概日変動を検討しているところである。Pdf mRNA発現の日周性については、現在in situハイブリダイゼーションを行うためのプローブの設計を行っている。