モデル下等生物を用いたタンパク質架橋酵素の未知生理機能の探索

利用低等生物模型探索蛋白质交联酶的未知生理功能

• 批准号: 03J00941
• 负责人: 和田 文孝
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00941/
• 关键词: 真正粘菌; トランスグルタミナーゼ; 傷害修復; 真性粘菌; 変形体; CBP40

本研究では、下等モデルとして真正粘菌を用いて、トランスグルタミナーゼ(TGase)の機能解析を行なってきた。真正粘菌のトランスグルタミナーゼ(PpTGase)は細胞が傷害を受けた際、細胞膜の修復に関与する可能性が示唆されているが、細胞傷害時にPpTGaseがどこで架橋活性を発揮し、どのような分子を基質とするかなど不明な点が多い。真正粘菌の変形体において、細胞傷害部位におけるPpTGaseの基質タンパク質の局在を解析したところ、基質タンパク質は細胞膜の傷害部位に局在することが明らかになった。また、これらの基質タンパク質を同定するためにアフィニティクロマトグラフィーを行ったところ、3種の主要なタンパク質(p44、p40、p33)が精製され、その内、p44とp40は質量分析によりそれぞれactinとカルシウム結合タンパク質、CBP40であった。P33はデータベース上にない未知のタンパク質であったため、p33を同定するために変形体から大量に精製し、部分アミノ酸配列を得て、その配列を元に遺伝子クローニングを行なった。その結果、p33はミトコンドリアの内膜に存在するANT(adenine nucleotide translocator)であることが明らかになった。また、actinとCBP40は傷害を受けた部位に局在したため、傷害部位でこれらのタンパク質が架橋化されることで何らかの機能を果たしていることが予想された。次に、動物細胞において細胞膜の傷害修復に対するTGaseの関与について検討した。TGase阻害剤存在下で動物細胞に物理的傷害を与え、傷害を受けた細胞膜の状態を調べた結果、TGase阻害剤存在下では細胞膜の修復が阻害された。さらに、TGase2の発現をRNAiにより抑制させ、その細胞に傷害を与えたところ、TGase2の発現が低下した細胞では細胞膜の傷害修復が抑えられた。以上の結果より、TGase2の架橋活性が細胞膜の傷害修復機構に関与することが示唆された。また動物細胞において、傷害に応じたTGaseの基質タンパク質としてスペクトリン、フィラミンA、クラスリンなどが同定された。これらの基質タンパク質が架橋化されることで細胞膜の修復機構に関与している可能性が考えられる。

在这项研究中，使用粘液霉菌作为较低模型对转谷氨酰胺酶（TGase）的功能分析进行。已经提出，当细胞受伤时，跨谷氨酰胺酶（PPTGase）是一种共晶粘液霉菌，可以参与细胞膜修复，但是有许多未知数，例如PPTGase在细胞损伤过程中施加交联活性及其使用的分子在哪些分子中用作替代物。在粘液模具的变体中，PPTGase底物蛋白在细胞毒性部位的定位表明，底物蛋白位于细胞膜中的损伤部位。此外，还进行了亲和力色谱以鉴定这些底物蛋白，并纯化了三种主要蛋白（p44，p40和p33），其中p44和p40分别是肌动蛋白，钙结合蛋白和CBP40，分别是质谱。因为p33是数据库中未发现的未知蛋白，因此从变体中进行了大量纯化以识别p33，并获得了部分氨基酸序列，并根据该序列克隆了基因。结果表明，p33是线粒体内膜中存在的腺嘌呤核转运剂（ANT）。此外，肌动蛋白和CBP40位于受伤部位，并预测这些蛋白质在受伤部位交联并执行了一些功能。接下来，检查了TGASE参与动物细胞中细胞膜损伤修复的参与。在存在TGASE抑制剂的情况下，对动物细胞的物理损害是引起的，并检查了受伤的细胞膜的状况，并在TGASE抑制剂存在下抑制了细胞膜修复。此外，当RNAi抑制TGASE2表达并受伤时，细胞膜损伤修复被抑制在TGASE2表达降低的细胞中。上述结果表明，TGASE2的交联活性与细胞膜的损伤修复机理有关。此外，对于动物细胞中的损伤，谱蛋白，丝蛋白A，网格蛋白等被鉴定为TGase的底物蛋白。这些底物蛋白可能通过交联参与细胞膜的修复机理。

项目成果

トランスグルタミナーゼによる低分子量GTP結合タンパク質の機能制御

转谷氨酰胺酶对低分子量 GTP 结合蛋白的功能调节

• 发表时间: 2005
• 期刊: 化学と生物 43
• 作者: 和田文孝