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細胞核におけるイノシトールリン脂質情報伝達系の制御機構と生理的意義の解明

阐明细胞核内肌醇磷脂信号转导系统的控制机制及生理意义

基本信息

批准号：
03J02037
负责人：
岡田雅司
金额：
$ 1.73万
依托单位：
University of Hyogo (2004-2005)Himeji Institute of Technology (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、高カルシウム濃度時にPLCd1はimportin b1と直接結合すること、細胞をカルシウムイオノフォアで処理するとPLCd1が核蓄積を起こすことを明らかにしてきた。活性中心のCa2+結合部位の変異体を細胞に発現させイオノマイシン処理を行うと、野生型と違い核蓄積が見られなかったことから活性中心のCa2+結合部位がPLCd1の核内輸送に必要であることが明らかとなった。生体内でこの現象が起きているかを確かめるために虚血性神経細胞死に焦点を当てた。まず、当研究室でラット海馬由来神経初代培養法を確立した。さらにイオノマイシン、タプシガルギン処理を行うと培養細胞と同様に内在性PLCd1の核局在が観察された。虚血性神経細胞死のモデル系である高濃度グルタミン酸処理でも内在性PLCd1の核局在が確認された。この核局在化にはどのような意義があるかを調べるために、PLCd1 KOマウスMEF細胞を用いて虚血などで頻度よく見られる核収縮に注目してイオノマイシン処理による実験を行った。レトロウイルスを用いたインフェクションの系を確立し、PLCd1KOMEFにGFP融合型PLCd1の変異体を各々感染させた株を樹立した。PLCd1が発現していないGFP発現株でもイオノマイシン処理で核収縮が観察されたことからPLCd1は高Ca2+濃度によって引き起こされる核収縮の必須因子では無いと言うことが明らかとなった。しかしPLCd1を発現させた細胞株では核収縮が促進され、逆にPLC活性が無くイオノマイシン処理で核移行を示さないPLCd1 E341A発現株では核収縮が抑制された。さらにNLSを融合させたコンストラクトを発現させた細胞株で同様の実験を試みたところ、NLS-PLCd1発現株では核収縮がコントロールに比べ促進したが、E341A発現株では変化が見られなかった。これらのことから細胞質側からもしくは細胞質から核への移行時にPLCd1が核収縮を引き起こすことが明らかとなった。またセミインタクト細胞を用いた核収縮アッセイを行ったところ、カルシウム濃度依存的にPLCd1はHeLa細胞の核を8割程度まで収縮させた。これらのことからPLCd1はその活性を軸として高Ca2+ストレスに晒された細胞の核を収縮させ、細胞死進行を亢進する因子の1つであることが示唆された。

In the past year, PLCd1 was directly bound to PLCd1 at high concentrations, and PLCd1 was accumulated in cells. The Ca2 + binding site of the active center is necessary for the intracellular transport of PLCd1. In vivo, the phenomenon of "blood deficiency" occurs in the brain. The primary culture method of hippocampus was established in the laboratory. In addition to the above, the internal PLCd1 of the cultured cells was observed. Blood cell death due to high concentrations of PLCd1 in the nucleus was confirmed. The frequency of MEF cell use in the process of nuclear degradation is discussed. The system of PLCd1 KOMEF and GFP fusion PLCd1 were established. PLCd1 was found in the GFP production plant, and the nuclear contraction was observed in the PLCd1 high Ca2 + concentration plant. PLCd1 was found to promote nuclear contraction and inhibit PLC activity without treatment of nuclear migration in PLCd1 E341A. The NLS fusion gene was developed by the same cell strain as the NLS fusion gene, and the NLS-PLCd1 fusion gene was developed by the same cell strain as the NLS fusion gene. In the case of nuclear migration, PLCd1 is the most important factor. The cell cycle is dependent on the concentration of PLCd1 and the cell cycle is dependent on the cell cycle. The activity of PLCd1 in these cells was increased by Ca2 + concentration, and the activity of PLCd1 in these cells increased by Ca2 + concentration.