HVJ-e法による骨新生未知遺伝子のスクリーニングと再生医療への応用

HVJ-e方法筛选未知成骨基因及其在再生医学中的应用

• 批准号: 03J04199
• 负责人: 原田 拓
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J04199/
• 关键词: HVJ-e; ライブラリースクリーニング; ES細胞; Cre recombinase

1.HVJ-e法の確立非ウイルスベクターであるHVJ envelope (以下、HVJ-6) vecterは細胞への膜融合による高効率かつ低侵襲な遺伝子導入が可能である。Mouse embryo pcDNA遺伝子ライブラリーをHVJ-eを用いてES細胞に導入し、その分化度をassayすることでhigh throughput screeningを行った。High sensitivityおよびhigh specificityのスクリーニングを行うために、骨芽細胞特異的プロモーターを有するレポーターベクターをCre-loxp systemと併用することで骨分化を誘導する遺伝子のクローニングを行った。2.同定・単離した遺伝子の機能解析約100クローンの遺伝子を1st. screeningにおいてクローニング、2nd. screeningを行ったうち5クローンの再現性を確認した。機能解析には、まずクローニング遺伝子の標的遺伝子の探索を行った。各クローニング遺伝子の強発現下、抑制下における各間葉系、骨分化マーカーを指標とした定量的RT-PCRを用いて検討し、上記の5クローンの骨分化課程における機能および役割の見当をつけた。次に生理的条件下の各クローニング遺伝子の発現を検討するために、未分化間葉系幹細胞にrhBMP2を用いて骨芽細胞へ分化誘導をかけ、分化段階における各遺伝子の発現パターンを定量的RT-PCR, Northern blotting, Western Blottingにて検討した。検討の結果、このうち2クローンの遺伝子が分化誘導に関与する可能性が極めて高いことが証明された。また、このうちの1クローンはHomeo box geneに属する既知遺伝子の一つであり、骨軟骨分化におけるこの遺伝子の機能に関しては、分子生物学において様々な報告がすでになされており、今回の実験における機能解析の対象とはしなかったが、HVJ-e法におけるスクリーニングの信頼性を裏付ける結果となりうるものと思われる。

1.HVJ-e method is established to establish the possibility of HVJ envelope (HVJ-6) vecter cell membrane fusion with high efficiency and low invasiveness. Mouse embryo pcDNA-derived DNA is used for high throughput screening of ES cells. High sensitivity, high specificity, high sensitivity, high specificity, high specificity, high sensitivity, high sensitivity, high specificity, high sensitivity, high 2. The functional analysis of the Tongding·Danli Shita genetic code is about 100 pieces of genetic code. screeningにおいてクローニング、2nd. Reproducibility of screening is confirmed. Function analysis, search engine search engine The expression and inhibition of the five genes in each mesenchymal lineage and bone differentiation index were detected by quantitative RT-PCR, and the function of the five genes in bone differentiation index was detected. The expression of rhBMP2 in undifferentiated mesenchymal stem cells was studied by quantitative RT-PCR, Northern blotting and Western Blotting. The results of this study show that the probability of differentiation between the two genes is very high. Homeo box gene belongs to a known gene, a function of the gene related to osteochondral differentiation, a report on molecular biology, a functional analysis of the target gene, HVJ-e method, a function of the gene related to information.