HVJ-e法による骨新生未知遺伝子のスクリーニングと再生医療への応用

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1.HVJ-e法の確立非ウイルスベクターであるHVJ envelope (以下、HVJ-6) vecterは細胞への膜融合による高効率かつ低侵襲な遺伝子導入が可能である。Mouse embryo pcDNA遺伝子ライブラリーをHVJ-eを用いてES細胞に導入し、その分化度をassayすることでhigh throughput screeningを行った。High sensitivityおよびhigh specificityのスクリーニングを行うために、骨芽細胞特異的プロモーターを有するレポーターベクターをCre-loxp systemと併用することで骨分化を誘導する遺伝子のクローニングを行った。2.同定・単離した遺伝子の機能解析約100クローンの遺伝子を1st. screeningにおいてクローニング、2nd. screeningを行ったうち5クローンの再現性を確認した。機能解析には、まずクローニング遺伝子の標的遺伝子の探索を行った。各クローニング遺伝子の強発現下、抑制下における各間葉系、骨分化マーカーを指標とした定量的RT-PCRを用いて検討し、上記の5クローンの骨分化課程における機能および役割の見当をつけた。次に生理的条件下の各クローニング遺伝子の発現を検討するために、未分化間葉系幹細胞にrhBMP2を用いて骨芽細胞へ分化誘導をかけ、分化段階における各遺伝子の発現パターンを定量的RT-PCR, Northern blotting, Western Blottingにて検討した。検討の結果、このうち2クローンの遺伝子が分化誘導に関与する可能性が極めて高いことが証明された。また、このうちの1クローンはHomeo box geneに属する既知遺伝子の一つであり、骨軟骨分化におけるこの遺伝子の機能に関しては、分子生物学において様々な報告がすでになされており、今回の実験における機能解析の対象とはしなかったが、HVJ-e法におけるスクリーニングの信頼性を裏付ける結果となりうるものと思われる。