全ゲノムデータベースを用いたトラフグ・ミオシン重鎖遺伝子の機能解析

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哺乳類のミオシン重鎖遺伝子(MyHC)には骨格筋タイプ6種、心筋タイプ2種、平滑筋タイプ3種および非筋タイプ3種のアイソフォームが存在することが知られている。このうち、骨格筋タイプ6種のMyHCはゲノム上でクラスターを形成する。この構造は哺乳類の多くの生物間で保存されているため、クラスター構造がMyHCの発現調節に重要な役割を果たしていることが予想される。一方、魚類のMyHCに関する知見は少なく、その正確な数さえも明らかになっていない。そこで本研究では、ゲノム配列が公開されているトラフグを対象にMyHCを解析し、個々の遺伝子につき分子生物学的手法を用いてその発現様式および転写調節機構を明らかにすることを目的とした。まず、トラフグMyHCを増幅するプライマーを設計するため、フグゲノムデータベースを利用してin silicoスクリーニングを行った。当研究室で先に決定したコイMyHCの塩基配列からアミノ酸配列を演繹し、それをTBLASTNプログラムにより縮重コドンを含む塩基配列に変換した。この塩基配列をプローブとしてin silicoスクリーニングを行ったところ、コイMyHCに相同な塩基配列を含む16個のscaffoldが検索された。各scaffoldから相同性を示した領域を抜き出し、WISE2プログラムによりエクソンおよびイントロン領域を推定した。さらに、各配列からイントロンを除いた後、Clustal Wプログラムによりアラインメントし、塩基同一率が高かった領域でプライマーを設計した。次に、骨格筋で発現するMyHCを同定するため、まず、トラフグ骨格筋からISOGEN (Nippon Gene)を用いてtotal RNAを抽出した。続いて、このRNAからSuperScript Plasmid System (Invitrogen)を用いてcDNAライブラリーを構築した。また、抽出したtotal RNAから別途1st strand cDNAを合成し、PCRによるcDNAクローニングのための鋳型とした。今後は、まず、PCRによりトラフグMyHCのcDNAクローニングを行う。続いて、得られたcDNA断片をプローブとしてライブラリースクリーニングを行い、骨格筋で発現するMyHCを同定する予定である。