超高分解能X線中性子線結晶構造解析を用いた酵素反応に関わる水素原子の機能解明

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一般酸塩基触媒により行われる糖質分解酵素エンドポリガラクツロナーゼの反応機構を水素原子の挙動を含め解明するため、1変異体酵素を用いた酵素基質複合体のX線結晶構造解析、2 超高分解能X線結晶構造解析、3 中性子結晶構造解析を行った。1 変異体酵素を用いた酵素基質複合体のX線結晶構造解析1 一般酸触媒残基Asp153と基質のグリコシド酸素間の水素結合の直接観察を目指し、変異体D153Nと基質オリゴガラクツロン酸との複合体のX線結晶構造解析を行った。測定は、40Kのクライオ条件下で測定を行った。その結果、0.85□の高分解能で-4〜+1のサブサイトに基質が結合した構造が得た。得られた構造は、昨年度得られたD173Nと基質の複合体の構造と比較した結果、Asp91付近のループの構造が異なっていた。D153N複合体のループ構造は、天然型酵素と反応生成物ガラクツロン酸(GalA)との複合体のそれと同じことから、より実際の酵素基質複合体に近い構造が得られたと考えられる。2 超高分解能X線結晶構造解析より高い分解能での構造解析を目指し、ヘリウムクライオの使用、大面積CCD検出器の使用、結晶の大型化等の改良を行いSPring-8のBL-41XUにおいて天然型酵素とGalAの複合体の測定を行った。その結果、0.60 □分解能に達する超高分解能のデータを得た。解析の結果、多数のマルチプルコンフォメーションが確認されるとともに多数の水素原子が2Fo-Fc電子密度図上で確認できた。3 中性子結晶構造解析D153N変異体と基質の中性子による構造解析を目指したが、X線による予備実験の結果、測定を行う室温条件下では基質が分解され解析不能なことが確認されたため断念した。そこで、昨年度の天然型酵素-GalA複合体のデータの完全性を向上させることを目的に、同じ条件でのデータ収集を行った。