超高分解能X線中性子線結晶構造解析を用いた酵素反応に関わる水素原子の機能解明

利用超高分辨率 X 射线中子晶体结构分析阐明参与酶反应的氢原子的功能

• 批准号: 03J04715
• 负责人: 清水 哲哉
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J04715/
• 关键词: 中性子結晶構造解析; 超高分解能X線結晶構造解析; グリコシダーゼ; エンドポリガラクツロナーゼ; 超高分解能結晶構造解析; 酵素反応機構; 中性子線結晶構造解析

一般酸塩基触媒により行われる糖質分解酵素エンドポリガラクツロナーゼの反応機構を水素原子の挙動を含め解明するため、1変異体酵素を用いた酵素基質複合体のX線結晶構造解析、2 超高分解能X線結晶構造解析、3 中性子結晶構造解析を行った。1 変異体酵素を用いた酵素基質複合体のX線結晶構造解析1 一般酸触媒残基Asp153と基質のグリコシド酸素間の水素結合の直接観察を目指し、変異体D153Nと基質オリゴガラクツロン酸との複合体のX線結晶構造解析を行った。測定は、40Kのクライオ条件下で測定を行った。その結果、0.85□の高分解能で-4〜+1のサブサイトに基質が結合した構造が得た。得られた構造は、昨年度得られたD173Nと基質の複合体の構造と比較した結果、Asp91付近のループの構造が異なっていた。D153N複合体のループ構造は、天然型酵素と反応生成物ガラクツロン酸(GalA)との複合体のそれと同じことから、より実際の酵素基質複合体に近い構造が得られたと考えられる。2 超高分解能X線結晶構造解析より高い分解能での構造解析を目指し、ヘリウムクライオの使用、大面積CCD検出器の使用、結晶の大型化等の改良を行いSPring-8のBL-41XUにおいて天然型酵素とGalAの複合体の測定を行った。その結果、0.60 □分解能に達する超高分解能のデータを得た。解析の結果、多数のマルチプルコンフォメーションが確認されるとともに多数の水素原子が2Fo-Fc電子密度図上で確認できた。3 中性子結晶構造解析D153N変異体と基質の中性子による構造解析を目指したが、X線による予備実験の結果、測定を行う室温条件下では基質が分解され解析不能なことが確認されたため断念した。そこで、昨年度の天然型酵素-GalA複合体のデータの完全性を向上させることを目的に、同じ条件でのデータ収集を行った。

Line general acid salt base catalyst に よ り わ れ る saccharide decomposing enzyme エ ン ド ポ リ ガ ラ ク ツ ロ ナ ー ゼ の を 応 authorities water element atoms の 挙 dynamic を containing め interpret す る た め, 1 1 - enzyme を い た enzyme complex matrix の X-ray crystal structure analysis, 2 high decomposition can be temper of X-ray crystal structure, three line crystal structure analytic を っ た. 1 - enzyme を allograft with い た enzyme complex matrix の X-ray crystal structure 1 general acid catalyst residue Asp153 と matrix の グ リ コ シ ド の water element combination between acid element の 観 directly examine を refers し, - variant D153N と matrix オ リ ゴ ガ ラ ク ツ ロ ン acid と の complex の X-ray crystal structure parsing line を っ た. Determine the で under the conditions of で, 40K, ラ and ラ で to determine the を rows った. Youdaoplaceholder0 そ results, 0.85□ <s:1> high decomposition energy で-4 to +1 <s:1> サブサ <s:1> トに matrix が combined with <s:1> た construction が obtained た. Have ら れ は た structure, yesterday's annual ら れ た D173N と の complex と の structure comparison matrix し た results, pay nearly の Asp91 ル ー プ の が different structures な っ て い た. は D153N complex の ル ー プ structure type, natural enzyme と anti 応 products ガ ラ ク ツ ロ ン acid (GalA) と の complex の そ れ と with じ こ と か ら, よ り be interstate の enzyme complex matrix に nearly い tectonic が have ら れ た と exam え ら れ る. 2 decomposition of ultra high energy X-ray crystal structure parsing よ り high い decomposition can で の structure を refers し, ヘ リ ウ ム ク ラ イ オ の use, large area CCD 検 extractor の using improved, such as crystallization の large-scale の を い SPring - 8 の BL - 41 xu に お い て type natural enzyme と GalA の complex の line measurement を っ た. Youdaoplaceholder0 そ results, 0.60 □ decomposition energy に reaches する, ultra-high decomposition energy デ デ タを タを た. Analytical の results, most の マ ル チ プ ル コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン が confirm さ れ る と と も に most の water element atoms が fo 2 - Fc electron density on 図 で confirm で き た. 3 temper crystallization structure D153N - variant と temper in the matrix の に よ る structure を refers し た が, X-ray に よ る reserve be 験 の results, determine を う room temperature で が は matrix decomposition さ れ resolution can't な こ と が confirm さ れ た た め desist し た. そ こ で, yesterday's annual の natural enzyme - GalA complex の デ ー タ の completeness を upward さ せ る こ と に を purpose, with じ condition で の デ ー タ 収 row っ を た.

项目成果

Reaction Mechanism on X-ray Crystallography at Atomic Resolution of Endopolygalacturonase I from Fungus Stereum purpureum

紫紫真菌内多聚半乳糖醛酸酶 I 的原子分辨率 X 射线晶体学反应机制

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Applied Glycoscience 51・2
• 作者: Tetsuya Shimizu;et al.
• 通讯作者: et al.

Expression, purification and crystallization of endopolygalaracturonase from a pathogenic fungus, Stereum purpureum, in Escherichia coli

病原真菌紫紫菌内切多聚半乳糖醛酸酶在大肠杆菌中的表达、纯化和结晶

• 发表时间: 2005
• 期刊: Protein Expression and Purification 44・2
• 作者: Tetsuya Shimizu;Hiroyuki Shibata;Tomoyuki Araya;Toru Nakatsu;Kazuo Miyairi;Toshikatsu Okuno;Hiroaki Kato
• 通讯作者: Hiroaki Kato

情水哲哉: "エンドガラクツロナーゼ : ガラクツロン酸複合体の原子分解能結晶構造"日本結晶学会誌. 45・5. 314-320 (2003)

Tetsuya Josui：“内切半乳糖醛酸酶：半乳糖醛酸复合物的原子分辨率晶体结构”日本晶体学会杂志45・5（2003）。