ノンヘム型の2価鉄イオンを含む-2原子酸素添加酵素の超高分解能X線結晶構造解析

含非血红素二价铁离子的双原子加氧酶超高分辨率X射线晶体结构分析

• 批准号: 09235210
• 负责人: 三井 幸雄
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09235210/
• 关键词: ノンヘム鉄; 2原子酸素添加酵素; ジオキシゲナーゼ; X線解析; 蛋白結晶学; 蛋白精造; ビフェニル分解代謝系; PCB分解代謝系

本研究では、活性中心の鉄イオンの周囲の電子密度(特に電子の局在化の様子)を1.2Å以上の高分解能で可視化する事を目的としている。本年度は、まず第一に高分解のX線回折像を与える良質の結晶の作成を、精製条件の再検討も含めて行った。具体的には精製段階においてイオン交換カラムの容量等、使用法を最適化することで、以前に比べて純度の高い蛋白質サンプルを得ることに成功した。更に、結晶化条件に関しても、より大粒の結晶を得るために、再検討を行った。その結果、現在までのHangind drop法からBatch法に変更することで、より大粒の結晶を得ることに成功した。以上に加え、高分解能回折データを測定するには、X線による結晶の損傷を最低限に押さえる必要がある。このためには、超低温での回折強度測定が効果的と考え、超低温(100K)での回折強度測定の為の条件検討を行った。その結果、BphC酵素の結果を30%のエチレングリコールを含む標準緩衝液(BphC酵素の結晶の保存溶液)に浸すことで、良好なデータ測定が可能なことを見出した。また、活性型(活性中心の鉄イオンが2価の状態)での構造解析を行うためには、無酸素的に結晶化を行い、活性中心の鉄イオンの酸化を防ぐ必要がある。このために、高度に酸素を取り除いた状態で結晶化を行うための装置を設計し、これを作成した。

This study で は の iron objects, activity center イ オ ン の weeks 囲 の electron density (に electronics の bureau in turn の others) を above 1.2 A の high decomposition can で visualization す る matter を purpose と し て い る. This year, the first に high-decomposition <e:1> X-ray reflection image を and える high-quality <s:1> crystallization <e:1> were made を, and the refining conditions <e:1> were further discussed 検 including めて and った. Specific に は refined Duan Jie に お い て イ オ ン exchange カ ラ ム の capacity etc., to use optimal を す る こ と で, before に than べ て の high purity い protein サ ン プ ル を must る こ と に successful し た. More に, crystallization conditions に masato し て も, よ り big grain crystallization の を る た め に, beg を again 検 っ た. そ の result, now ま で の Hangind drop method か ら に Batch method - more す る こ と で, よ り big grain crystallization の を る こ と に successful し た. Above に え, high decomposition can inflexion デ ー タ を determination す る に は, X-ray に よ る crystallization の damage を minimalist に detain さ え る necessary が あ る. こ の た め に は, cryogenic で の inflexion strength measurement が unseen fruit と exam え, ultra-low temperature (100 k) で の の is の condition in determination of inflexion strength 検 line for を っ た. そ の results, BphC enzyme の を 30% の エ チ レ ン グ リ コ ー ル を including む standard buffer (BphC enzyme の crystallization の preservation solution) に leaching す こ と で, good な デ ー タ determination が may な こ と を shows し た. ま た, activity type (active center の iron objects イ オ ン が 2 価 の state) で の structure line を う た め に は, acid free element に crystallization を い, active center の iron objects イ オ ン の acidification を ぐ necessary proof が あ る. こ の た め に, highly に acid element を take り except い た state で crystallization を line う た め し を の device design, こ れ を made し た.

项目成果

Nandhagopal,N., Senda,T., Hatta,T., Yamada,A., Masai,E., Fukuda,M. & Mitsui,Y.: "Three-dimensional structure of microbial 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienole acid (HPDA) hydrolase (BphD enzyme) from Rhodococcus sp. stratin RHA I,in the PCB degradatio

Nandhagopal,N.、Senda,T.、Hatta,T.、Yamada,A.、Masai,E.、Fukuda,M.

Mitsui,Y. & Senda,T.: "Elucidation of the basic three-dimensional structure of Type I interferons and its functional and evolutionary implications." J.Interferon and Cytokine Res.17. 319-326 (1997)

三井，Y.