遺伝子活性化基質を用いた硬組織の再生

点击翻译按钮获取中文摘要

既にクローニングされているBMP-2のcDNAを蛋白発現プラスミドベクター(Flag pc DNA3)に組み込んだ。このライゲーション後のプラスミドを大腸菌の中にトランスフォーメーションし、増殖させる。BMP-2のcDNAが正しく組み込まれているかを大腸菌からプラスミドをミニプレップにより調整し、これを制限酵素処理してインサートを確認した。また、このサブクローニングしたプラスミドベクターをIn vitroで293細胞にノンリポソーマルトランスフェクションキットを用い、遺伝子導入した。この遺伝子導入された細胞が目的の蛋白質BMP-2を発現、分泌するかどうかを、細胞をライセートして、細胞内の蛋白質と培養上澄のウエスタンブロットを行うことにより確認した。このBMP-2発現プラスミドをIn vivoで確認するため、プラスミドをマキシプレップにて大量に増殖させて、直接コラーゲンに濃度を変化させて含浸させ、ヌードマウスの筋肉内に埋入し、骨形成能を検討したが骨形成は認められなかったため、コラーゲンを当大学整形外科で開発された多孔質ハイドロキシアパタイト・コラーゲン複合体(HAp/col)に含浸させ、4週、8週、12週で再度検討したが骨形成は認められなかった。異所性に骨形成が得られないため、ラット頭蓋骨に骨欠損を形成し、その骨の場で差が得られるかどうかについて4週、8週、12週で検討したが、今回は骨形成が認められたもののプラスミド含浸させたものと単独移植との間に有意差は認められなかった。そこで、エレクトロポレーションを用いて移植直後、1日後、直後から毎日3日間遺伝子導入を行った場合で比較検討を行った。結果、すべての場合において骨形成は認められたがそれにより骨形成が促進される傾向にあったが、各群における有意差は認められなかった。