カニクイザル脳組織を用いたアルツハイマー病発症機構の解明

利用食蟹猴脑组织阐明阿尔茨海默病的发病机制

• 批准号: 03J11365
• 负责人: 木村 展之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J11365/
• 关键词: アストログリア; ラットとカニクイザルの種差; ロイシンリッチリピート構造; LGI3; 細胞内Aβ; 神経終末

(1)比較的低濃度(2および5μM)のAβをラットおよびカニクイザル胎仔大脳皮質初代培養系に加え、最大14日間にわたるAβの神経系細胞に与える影響を組織学的および生化学的に検索した。本実験で角いた培養系には神経細胞のみならず各種グリア細胞も存在しており(神経細胞が9割以上を占める)、実際の脳内に近い状態で検索できるという利点がある。この結果、ラット、カニクイザル培養系ともに、Aβ添加14日後でもアポトーシス細胞の有意な増加は見られず、各種蛋白群の蛋白発現量に変化は見られなかった。一方、ラット、カニクイザル培養系ともに、アストログリア(AG)関連蛋白であるGFAPおよびApoE蛋白量の有意な増加が見られ、増加度はラットの方が顕著であった。また、より毒性の高い分子種であるAβ42添加群において有意な蛋白発現上昇が確認された。このことから、Aβが蓄積し始める加齢およびAD進行初期においては、神経細胞よりもむしろAGの対Aβ反応が主に生じていることが示唆された。(2)Aβが直接AGを刺激しているのかどうかを確認するため、Conditioned-Medium (CM)実験系を用いてAGの対AB反応経路を検索した。(神経細胞を主構成成分とする初代培養系にAβを添加・培養した後の培養液をCMとして用いた。)この結果、ラットおよびカニクイザルAGは直接Aβに刺激されることで活性化が生じる(GFAP増加)ことが明らかになった。一方、ApoE産生経路には両者に種差が見られた。ラットAGはCM添加群においてApoE産生量の有意な増加が見られたのに対し、カニクイザルAGは直接Aβを添加した群でのみ、ApoE産生量の有意な増加が確認された。(3)Aβの生理学的機能は未だ不明である。昨今の研究により、ロイシンリッチリピート構造(LRR)を持つ蛋白をコードする遺伝子が、Aβ添加により遺伝子発現が上昇することがin vitroで確認された。そこで私は、同じくLRRを持つLGI3のラットにおける塩基配列およびアミノ酸配列を明らかにし、ラット培養系にてAβ添加による同遺伝子発現の検索を行った。塩基配列同定の結果、ラットLG13はアミノ酸レベルでヒトと90%以上の相同性を持つことが明らかになった。ラットLGI3は、主に大脳皮質で発現していることが明らかになり、且つAGで強く発現することが明らかになった。Aβ40添加により、ラットAG単独培養系で有意なLGI3発現上昇が確認された。Aβ40は生体内で恒常的に産生されるAβ分子種であることから、LGI3はAβの脳内における正常機能に関与していることが示唆された。(4)老齢のヒト脳およびAD患者脳では神経細胞内にAβが蓄積し、この細胞内Aβ蓄積がAD病態に深く関与しているのではないかと大きな注目を浴びている。そこで細胞内Aβに注目し、脳内局在および加齢性変化を検索した。その結果、PFA固定・過ヨウ素酸前処理・オートクレーブ処理の組み合わせにより、若齢カニクイザル脳における細胞内Aβの染色に成功した。細胞内Aβは主に大型錐体神経細胞の胞体内および大型神経細胞の突起に顆粒状に存在し、老齢個体の神経細胞内ではやや凝集して偏在することが明らかになったが、加齢に伴う顕著な増加はみられなかった。生化学的検索より、マイクロゾーム分画で加齢性にAβ42蛋白量が増加し、Aβ43蛋白量が顕著に減少していた。Aβ40および総Aβ量に変化が見られなかったことから、カニクイザル脳では主にAβ40と43が産生されており、加齢性にAβ42産生量が増加することが明らかになった。神経終末分画では総Aβ量の加齢に伴う増加が見られ、Aβ分子種によらず加齢性蛋白量増加が確認された。神経終末分画におけるこれらAD関連蛋白の蓄積は、神経終末における蛋白輸送および細胞内での蛋白代謝能低下に由来しているのではないかと考えられる。また、このような細胞内蛋白代謝の制御不能が神経細胞全体の機能低下および細胞死に繋がる可能性がある。

(1)Compared with low concentrations (2 μ M to 5 μ M) of A β in fetal cortex primary culture lines, the maximum 14 days of A β in neurologic cells and the effects of A β on histology and biochemistry. In this paper, the culture system is composed of various kinds of cells, such as neurocytes, neurocytes The results showed that the protein production of various protein groups increased after 14 days of A β addition. The amount of GFAP and ApoE protein in a culture system is intentionally increased. A β 42 addition to the toxic high molecular species was identified as an intentional increase in protein expression. A β accumulation begins in the brain, and A β accumulation begins in the brain. (2)Aβ-AG direct stimulation, Conditioned-Medium (CM) system and AB reverse channel detection (A β was added to the culture medium after the primary culture system was cultured, and CM was added to the culture medium after the primary culture system was cultured) The results of this study are as follows: (1) Direct A β stimulation (GFAP increase);(2) Direct A β stimulation (GFAP increase); One side, ApoE generation path, seed difference Intentional increase in ApoE production due to CM addition was confirmed. (3)A The physiological function of β is unknown. In recent studies, it has been confirmed that protein expression and A β addition in LRR are increasing in vitro. The development of A β-added isozymes in culture systems was investigated in the presence of A β-added isozymes. Based on the same results, LG 13 has more than 90% identity. LGI 3 is the main part of the large cortex, and the main part of the cortex is the main part of the large cortex. A β 40 addition was confirmed to increase LGI 3 expression in isolated culture lines. A β 40 is constantly produced in vivo, which is related to the normal function of A β in LGI 3. (4)The accumulation of A β in the brain cells of patients with AD is closely related to the pathogenesis of AD. A β is present in the cells, and a β is present in the cells. Results: PFA fixation, acid pretreatment, and intracellular A β staining were successful. Intracellular A β is present in granular form in the cytoplasm of large pyramidal neurons and in the processes of large neurons, and in the cytoplasm of elderly neurons. Biochemical analysis showed that the amount of A β 42 protein increased and the amount of A β 43 protein decreased. A β 40 and A β 42 are produced in a variety of ways, such as by increasing A β 40 and A β 43 production. The increase in the amount of total A β in the brain was confirmed by the increase in the amount of total A β molecular species. The accumulation of AD-related proteins in the brain terminal and the protein transport in the brain terminal and the decrease of protein metabolic energy in the cell It is possible that the control of intracellular protein metabolism cannot cause the dysfunction of the whole brain cell and the death of the cell.

项目成果

Kimura N, Tanemura K, Nakamura S, Takashima A, Ono F, Sakakibara I, Ishii Y, Kyuwa S, Yoshikawa Y.: "Age-Related Changes of Alzheimer's Disease-associated proteins Cynomolgus Monkey Brains"Biochemical and Biophysical Research Communications. 310. 303-311

Kimura N、Tanemura K、Nakamura S、Takashima A、Ono F、Sakakibara I、Ishii Y、Kyuwa S、Yoshikawa Y.：“阿尔茨海默病相关蛋白食蟹猴大脑的年龄相关变化”生物化学和生物物理研究通讯。