昆虫細胞発現系を用いたヒトコネキシン26の発現・精製・結晶化とX線結晶構造解析

ヒト肝臓のcDNAからクローニングしてきたヒトコネキシン26をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞Sf9を用いてギャップジャンクションを形成させた。アルカリ精製によるギャップジャンクション膜画分の精製、可溶化後の陽イオン交換樹脂による精製によって純度の高い精製コネキシンを得ることができた。この精製コネキシンを濃縮しハンギングドロップ法によって結晶化を試みたところ、いくつかの条件で微小な結晶が出来ているのが観察された。その後、条件の検討を重ねることで長辺が200〜300μm程度の結晶を得るまでに至った。この結晶をSpring8 BL44XUに持ち込み、放射光を当てたところ、6〜7Å程度の分解能の反射点が得られた。また、一方向のみであるが、4.4Å分解能を与える反射点を観測することもできた。しかしながら、この程度の分解能では原子モデルを構築するにはまだほど遠いため、さらなる高分解能データが必要である。そこで、これまでの蒸気拡散法に変わる手法として微量透析法による結晶化を行った。微量透析法では、透析外液の組成を変えることで正確に結晶化条件を設定することができる。この方法で結晶化を試みたところ、蒸気拡散法とほぼ同一の条件で結晶を得ることができた。しかしながら得られた結晶は薄い板状であり、反射点も平均して8〜9Å程度と期待されたほどではなかった。今後は結晶化条件を検討することにより厚みのある大きな結晶を作成することを目標として(当然ながらより良い反射を与える結晶であることが前提である。)実験を進めていく方針である。

ヒト肝臓のcDNAからクローニングしてきたヒトコネキシン26をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞Sf9を用いてギャップジャンクションを形成させた。アルカリ精製によるギャップジャンクション膜画分の精製、可溶化後の陽イオン交換樹脂による精製によって純度の高い精製コネキシンを得ることができた。この精製コネキシンを濃縮しハンギングドロップ法によって結晶化を試みたところ、いくつかの条件で微小な結晶が出来ているのが観察された。その後、条件の検討を重ねることで長辺が200〜300μm程度の結晶を得るまでに至った。この結晶をSpring8 BL44XUに持ち込み、放射光を当てたところ、6〜7Å程度の分解能の反射点が得られた。また、一方向のみであるが、4.4Å分解能を与える反射点を観測することもできた。しかしながら、この程度の分解能では原子モデルを構築するにはまだほど遠いため、さらなる高分解能データが必要である。そこで、これまでの蒸気拡散法に変わる手法として微量透析法による結晶化を行った。微量透析法では、透析外液の組成を変えることで正確に結晶化条件を設定することができる。この方法で結晶化を試みたところ、蒸気拡散法とほぼ同一の条件で結晶を得ることができた。しかしながら得られた結晶は薄い板状であり、反射点も平均して8〜9Å程度と期待されたほどではなかった。今後は結晶化条件を検討することにより厚みのある大きな結晶を作成することを目標として(当然ながらより良い反射を与える結晶であることが前提である。)実験を進めていく方針である。