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細胞表層に存在する膜貫通型蛋白質への機能性分子導入法の開発

开发将功能分子引入细胞表面跨膜蛋白的方法

基本信息

批准号：
15750137
负责人：
築地真也
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、細胞表層の膜貫通型蛋白質の細胞外および細胞内ドメインに様々な機能性合成分子を導入するための半合成的手法の開発を目指している。そのための基本戦略として、細胞内で発現させた蛋白質フラグメントと細胞外で調整した合成蛋白質フラグメントをSsp DnaEインテインのtrans-スプライシング活性を利用して連結させるというアプローチを試みている。現在、この手法の有効性を検証することを目的として、膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインに大腸菌発現蛋白質あるいは合成小分子を組み込むことを行っている。そのモデル実験として血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)の膜貫通ドメインをターゲットにしており、PDGFR膜貫通ドメインのN末端にDnaE(C)を融合させたキメラ蛋白質の発現ベクターを作成した。このプラスミドを動物細胞内(HEK293)で発現させ、タグの免疫蛍光染色を用いてDnaE(C)ドメインが望み通り細胞の外に提示されていることを確認した。また大腸菌発現系を利用してGST-TEVproteaseSite-DnaE(N)というコンストラクトを調整した。更にこのコンストラクトをTEVプロテアーゼによって切断後、N末端に生じるシステイン残基を狙って特異的に合成小分子(フルオレセインやビオチン等)を修飾した。現在、動物細胞上でのtrans-スプライシング反応および細胞表層への蛋白質あるいは小分子ラベリングについて評価し、細胞外ドメインの化学半合成というアプローチの可能性について検討を進めている段階である。

In this study, cell surface proteins, cell surface proteins, extracellular proteins, extracellular proteins, functional synthetic molecules, functional synthetic molecules and semisynthetic molecules were detected. In general and intracellular conditions, we can see that there are some proteins in the cells, such as protein synthesis, Ssp DnaE synthesis, protein synthesis. At present, there are some methods for the synthesis of small molecules, such as the synthesis of small molecules, the synthesis of small molecules, and the synthesis of small molecules. Thrombocytopenia (PDGFR): the membrane of colonization factor receptor (PDGFR), the membrane of PDGFR, the fusion protein, the fusion protein. The intracellular (HEK293) and immunocytochemical staining of the animal was detected. The DnaE (C) immunostaining was used to detect the extracellular signal of the animal. The department uses GST-TEVproteaseSite-DnaE (N) to clean up the whole body. After being cut off, the N-terminal synthetic small molecules (synthetic molecules, etc.) of the N-terminus of TEV were synthesized. Now, on the animal cell, we need to trans- the protein in the cell, the protein in the cell.