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遺伝子にコードされた蛋白質を用いた細胞内シグナル伝達の光制御技術の開発

利用基因编码蛋白开发细胞内信号转导光控技术

基本信息

批准号：
17655073
负责人：
築地真也
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17655073/
关键词：
ケージド蛋白質 Phytochrome B PIF3

项目摘要

細胞内シグナル伝達を「光」を用いて、望みのタイミングや望みの場所で活性化あるいは不活性化するための技術は、細胞生物学や細胞工学における強力な研究ツールとなりうる。特に、キナーゼ群によるリン酸化カスケードは多彩な細胞機能の中枢を担っており、細胞内キナーゼの活性状態を光で人為的にオン-オフ制御するための方法論の確立は極めて重要であると考えられる。そのための化学的アプローチとして、光分解性保護基を利用したケージド蛋白質が使用されてきた。しかし、そのケージド蛋白質の合成は決して容易ではなく、またそれを細胞内で応用するためには、マイクロインジェクションなどの熟練した技術が必要になる。そこで本研究では、遺伝子にコードされた蛋白質を用いて、生細胞内キナーゼの活性を時空間的に光制御するための基礎技術の開発を試みる。具体的には、植物シロイヌナズナ由来の光受容蛋白質PhyBおよびその相互作用パートナーPIF3の赤色光依存的な二量体形成を基本原理として利用する。そこで本年度はまず、1)PhyBとPIF3が動物細胞内で発現されるか?、そして2)赤色光によって二量体を形成するか?の二点について確認を行うことを目標に実験を進めた。PhyBおよびPIF3のさまざまな改変体および緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合体の発現プラスミドを作成し、いくつかの細胞株を用いて遺伝子発現を行った。GFP由来の蛍光観察やウエスタンブロッティングなどの実験の結果、これまでに、PIF3の発現は確認できているが、PhyBの発現が全く確認できていない。もともとこれらの蛋白質は植物由来であるため、転写後のスプライシング、コドンの使用頻度、発現後の細胞内安定性の問題などが考えられる。そこで、今後はこれらの可能性について一つずつ検証を進めて行く予定である。

Inactivation of the cell, cell biology and cell engineering. The establishment of methodology for controlling the activity of intracellular enzymes is extremely important. The use of photolytic protective groups in the production of proteins The synthesis of protein is easy, and it is necessary to use it in cells. This study aims to explore the development of basic technologies for the regulation of intracellular protein activity in vivo and in vitro. The basic principle and utilization of the interaction between the photoreceptive protein PhyB and the red photodependent protein PIF3 in plants 1)PhyB and PIF3 are found in animal cells. 2) Red light and two quantities are formed. The two points are confirmed. PhyB and PIF3 fusion protein and green fluorescent protein (GFP) fusion protein development strategy was developed and the fusion protein development was carried out in cell lines. The origin of GFP was detected by optical microscope, and the results of the experiment were analyzed. The occurrence of PIF3 was confirmed. The occurrence of PhyB was confirmed. The origin of the protein in the plant, the frequency of its use, and the intracellular stability after its occurrenceそこで、今后はこれらの可能性について一つずつ検证を进めて行く予定である。