線虫における二重の酵素機能を持つタンパク質、Bam-1の構造と機能

本研究は線虫に見い出された神経分岐に異常をきたす原因遺伝子産物であるBam-1タンパク質が、我々が見い出した糖鎖脱離酵素PNGaseホモログであるという知見を契機として、そのタンパク質の生化学的性質を調べて、表現型発現のメカニズムに迫るのが目的である。本酵素はN端にチオレドキシンドメイン、中央にPNGaseドメインを持ち、構造上2重の酵素活性を持つことが予想されていた。昨年までの研究で、本酵素のPNGaseドメインに変異が入ることで神経分岐の異常がもたらされ、チオレドキシンドメインに変異が見出されなかったことから、PNGase活性と表現型の関連性があることが明らかになった。また、我々が開発したin vitroの酵素活性アッセイ法を用いて(下記研究発表参照)、Bam-1タンパク質がPNGaseを活性を持つこと、また出芽酵母を用いたin vivoのアッセイ法を用いてチオレドキシン活性の存在を明らかにしている。今年度はさらに本タンパク質の酵素活性を明確にするために、PNGase活性に関してやはり出芽酵母を用いて、植物由来のタンパク質であるリ生体内でのリシン無毒化変異体を用いた小胞体関連分解(ERAD)のアッセイ系を確立し、このタンパク質がin vivoにおいてPNGaseによる糖鎖の脱離をうけるかどうかを調べた。その結果、PNGaseがリシンを基質として糖鎖の脱離を行うことをウエスタン解析により見い出し、in vivoのPNGase活性測定系を確立した。今回この系を用いて線虫の酵素活性をin vivoにおいても活性測定が出来ることが分かった。

本研究は線虫に見い出された神経分岐に異常をきたす原因遺伝子産物であるBam-1タンパク質が、我々が見い出した糖鎖脱離酵素PNGaseホモログであるという知見を契機として、そのタンパク質の生化学的性質を調べて、表現型発現のメカニズムに迫るのが目的である。本酵素はN端にチオレドキシンドメイン、中央にPNGaseドメインを持ち、構造上2重の酵素活性を持つことが予想されていた。昨年までの研究で、本酵素のPNGaseドメインに変異が入ることで神経分岐の異常がもたらされ、チオレドキシンドメインに変異が見出されなかったことから、PNGase活性と表現型の関連性があることが明らかになった。また、我々が開発したin vitroの酵素活性アッセイ法を用いて(下記研究発表参照)、Bam-1タンパク質がPNGaseを活性を持つこと、また出芽酵母を用いたin vivoのアッセイ法を用いてチオレドキシン活性の存在を明らかにしている。今年度はさらに本タンパク質の酵素活性を明確にするために、PNGase活性に関してやはり出芽酵母を用いて、植物由来のタンパク質であるリ生体内でのリシン無毒化変異体を用いた小胞体関連分解(ERAD)のアッセイ系を確立し、このタンパク質がin vivoにおいてPNGaseによる糖鎖の脱離をうけるかどうかを調べた。その結果、PNGaseがリシンを基質として糖鎖の脱離を行うことをウエスタン解析により見い出し、in vivoのPNGase活性測定系を確立した。今回この系を用いて線虫の酵素活性をin vivoにおいても活性測定が出来ることが分かった。